趙美茜，白忠義，張祥輝，劉金亮，潘洪玉，張艷華

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062）

玉米ZeamaysL.是世界上最主要的糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著重要的作用。玉米生產(chǎn)受到莖腐病的嚴(yán)重影響，莖腐病是最廣泛和最具破壞性的土傳病害之一[1]。莖腐病主要由幾種鐮孢菌引起，如禾谷鐮孢Fusariumgraminearum、輪枝鐮孢F.verticillioides和層出鐮孢F.proliferatum等[2-4]。其中，禾谷鐮孢是引起玉米莖腐病的主要病原體，而且它能產(chǎn)生多種真菌毒素，降低玉米品質(zhì)[5-7]。在我國(guó)由玉米莖腐病造成的損失從5%到80%不等，因此，控制禾谷鐮孢引起的莖腐病具有重要意義[8,9]。

目前，玉米莖腐病的防治主要依賴(lài)于抗性品種和化學(xué)殺菌劑。然而高抗莖腐病的品種資源不足，選育抗莖腐病的玉米品種耗時(shí)費(fèi)力[10,11]?；瘜W(xué)防治方法存在成本高、環(huán)境污染、農(nóng)殘殘留以及食品安全等問(wèn)題[12]。因此，生物防治方法作為可持續(xù)發(fā)展的新興技術(shù)，研究日益深入。木霉和芽胞桿菌是目前用于防治玉米莖腐病最為廣泛的菌株[13-16]。

本研究從玉米根際土壤中分離獲得一株具有良好生防效果的細(xì)菌菌株CSR-2，該菌株對(duì)多種植物病原真菌均具有拮抗作用，影響禾谷鐮孢菌絲生長(zhǎng)、菌絲形態(tài)及孢子萌發(fā)。將該菌株與玉米膜下滴灌水肥藥一體化技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，對(duì)莖腐病防治效果顯著。通過(guò)第三代PacBio全基因組測(cè)序分析，并結(jié)合平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity，ANI）對(duì)生防菌株CSR-2的分類(lèi)地位進(jìn)行鑒定，為深入挖掘其生防潛力及次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇用于農(nóng)業(yè)生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 禾谷鐮孢、稻瘟菌Magnaportheoryzae、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、核盤(pán)菌Sclerotinia sclerotiorum、玉米灰斑病菌Cercosporazeae-maydi、玉米小斑病菌Helminthosporiummaydis及立枯絲核菌Rhizoctoniasolani，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 生防菌菌株 取玉米根際土壤，利用平板對(duì)峙法進(jìn)行生防菌株的初篩、復(fù)篩，獲得對(duì)植物病原真菌具有拮抗作用的菌株CSR-2。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L；綠豆培養(yǎng)基：綠豆40 g/L，瓊脂粉20 g/L。以上培養(yǎng)基均121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 菌株CSR-2接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h后，用LB液體培養(yǎng)基將發(fā)酵液稀釋到OD600＝0.6。

1.2.2 病原菌分生孢子懸浮液制備 灰葡萄孢和玉米小斑病菌分別接種于PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～7 d，在平板中加入5 mL無(wú)菌水沖洗，用三層無(wú)菌紗布過(guò)濾，利用無(wú)菌水將各孢子懸浮液稀釋至105CFU/mL，獲得灰葡萄孢和玉米小斑病菌分生孢子懸浮液。禾谷鐮孢接種于PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d，用打孔器取邊緣菌餅接種于50 mL綠豆培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)96 h，加無(wú)菌水稀釋至105CFU/mL，獲得禾谷鐮孢分生孢子懸浮液。

1.2.3 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制能力測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定CSR-2發(fā)酵液對(duì)多種植物病原真菌的抑制活性。在直徑為9 cm的PDA平板中心接種直徑為8 mm活化的病原真菌（禾谷鐮孢、稻瘟菌、灰葡萄孢菌、核盤(pán)菌、玉米灰斑病菌、玉米小斑病菌及立枯絲核菌）菌餅。在距中心25 mm處放置面積為1 cm2無(wú)菌濾紙片，取10 μL菌株CSR-2發(fā)酵液接種于無(wú)菌濾紙片上，以?xún)H接種病原真菌的PDA平板作為對(duì)照。通過(guò)計(jì)算抑菌率，評(píng)估菌株CSR-2發(fā)酵液的抑制活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。抑菌率（%）＝（對(duì)照菌落半徑－處理菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑×100。

1.2.4 對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響 按照1.2.3的處理方法，將菌株CSR-2發(fā)酵液（OD600＝0.6）與病原菌共培養(yǎng)在 PDA平板上，在菌絲邊緣斜插入滅菌后的蓋玻片，待菌絲生長(zhǎng)至蓋玻片上，在顯微鏡下觀察處理組與對(duì)照組病原菌菌絲形態(tài)。

1.2.5 對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制能力測(cè)定 將菌株CSR-2接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。利用LB液體培養(yǎng)基將發(fā)酵液稀釋到OD600分別為0.15、0.3、0.6。取等體積的發(fā)酵液與禾谷鐮孢分生孢子懸浮液混合置于凹面載玻片上，每個(gè)濃度重復(fù)2次。從接種開(kāi)始每隔1 h于光學(xué)顯微鏡下觀察（20×20），每個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)3個(gè)視野區(qū)域，每個(gè)視野區(qū)域觀察約50個(gè)孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算各處理的孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率（%）＝孢子萌發(fā)數(shù)量/視野內(nèi)孢子數(shù)量×100。

1.2.6 菌株CSR-2對(duì)玉米莖腐病防治效果的田間試驗(yàn) 試驗(yàn)于2020年5月至10月在吉林省松原市乾安縣贊字鄉(xiāng)父子村水肥藥一體化試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)置無(wú)藥劑處理的陰性對(duì)照（CK）、2%戊唑醇懸浮種衣劑包衣、生防菌CSR-2處理3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)50 m2，3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)。將禾谷鐮孢接種到滅菌帶殼高梁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)3 d，至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)高梁粒表面。玉米田間播種時(shí)，同時(shí)播種3 g處理好的帶菌高梁粒，播種深度為4～5 cm。生防菌施用是借助水肥藥一體化裝置采用玉米膜下滴灌的方式，分別在播種前期、3葉期、8～10葉期3次進(jìn)行，生防菌濃度為1.5×108CFU/mL，按照1 L/m2劑量施用。玉米莖腐病的田間防效采取棋盤(pán)式取樣，每個(gè)樣點(diǎn)調(diào)查 10株，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)和防治效果。病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.3 全基因組序列測(cè)定和分析

1.3.1 DNA提取、基因組測(cè)序及組裝 采用改進(jìn)的 CTAB法從菌株 CSR-2中提取基因組 DNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）、Qubit dsDNA HS檢測(cè)試劑盒（Qubit 3.0熒光儀）和0.8%凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。使用G-tubes（Covaris）將合格的基因組DNA片段化并進(jìn)行末端修復(fù)，制備SMRTbell DNA文庫(kù)（片段大小為＞10 kb，采用Blue Pippin系統(tǒng)）。利用Qubit分析文庫(kù)質(zhì)量，Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，Santa Clara，CA，USA）估計(jì)片段平均大小。SMRT測(cè)序采用Pacific Biosciences Sequel II測(cè)序儀（Frasergen Bioinformatics Co.，Ltd，Wuhan，China）。利用Microassembly（smrtlink8）、HGAP4 及 Canu（v.1.6）重新組裝 PacBio reads，使用 pbalign（BLASR, v0.4.1）分析基因組覆蓋深度，利用Circos（v0.64）獲得菌株CSR-2的基因組圈圖[17-20]。

1.3.2 基因組的注釋及菌株鑒定 菌株CSR-2的全基因組用Glimmer（v3.02）注釋[21]。核糖體RNA基因用 RNAmmer（v1.2）鑒定，tRNA 基因用 tRNAscan-SE（v2.0）驗(yàn)證。對(duì) NR、SwissProt、COG、KEGG及GO進(jìn)行BLAST全基因組搜索（e值閾值為1e-5），選擇得分最高的作為最后的注釋[21-23]。利用OAT（0.90）計(jì)算菌株CSR-2與其他菌株全基因組序列的平均核苷酸同源性（ANI），通過(guò)BLASTx對(duì)NR與NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定菌株CSR-2。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CSR-2抑菌活性

采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)從玉米根際土壤中分離到的菌株CSR-2進(jìn)行抑菌活性分析結(jié)果顯示，菌株CSR-2對(duì)禾谷鐮孢、玉米小斑病菌、稻瘟菌、灰葡萄孢菌、核盤(pán)菌、玉米灰斑病菌以及立枯絲核菌均有明顯的抑制效果，形成明顯的抑菌帶，抑制率為60.6%～66.8%（圖1）。上述結(jié)果表明，生防菌CSR-2對(duì)多種植物病原真菌有較強(qiáng)的拮抗作用，顯著抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)，并具有一定的廣譜性。

圖1 菌株CSR-2對(duì)植物病原真菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of strain CSR-2 on plant pathogenic fungi

2.2 菌株CSR-2對(duì)病原真菌菌絲形態(tài)以及孢子萌發(fā)的影響

將菌株CSR-2發(fā)酵液分別與禾谷鐮孢、立枯絲核菌、玉米灰斑病菌共培養(yǎng)在PDA平板上，在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲形態(tài)。結(jié)果表明，對(duì)照組3種病原菌的菌絲表面光滑，粗細(xì)一致，滲透性正常，內(nèi)含物分布均勻。處理組禾谷鐮孢菌絲表面褶皺，粗細(xì)不均；處理組立枯絲核菌與玉米灰斑病菌菌絲出現(xiàn)內(nèi)含物分布不均勻且外溢的現(xiàn)象，表明菌株CSR-2能夠破壞病原菌菌絲的結(jié)構(gòu)，抑制菌絲的生長(zhǎng)（圖2）。

圖2 菌株CSR-2對(duì)病原真菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effects of strain CSR-2 on mycelial morphology of plant pathogenic fungi

利用OD600＝0.15、0.3與0.6的菌株CSR-2發(fā)酵液處理禾谷鐮孢分生孢子懸浮液。結(jié)果顯示，對(duì)照組分生孢子在培養(yǎng)3 h時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，從其一端或兩端長(zhǎng)出芽管，5 h后即可形成菌絲。而用菌株CSR-2發(fā)酵液（OD600＝0.6）處理的分生孢子表面皺縮，滲透性異常，5 h后分生孢子不能萌發(fā)形成菌絲。用OD600＝0.3發(fā)酵液處理3 h，分生孢子不能正常萌發(fā)，5 h后部分孢子開(kāi)始形成芽管。發(fā)酵液濃度為OD600＝0.15時(shí)對(duì)分生孢子形態(tài)影響較小，3 h時(shí)多數(shù)孢子可以正常萌發(fā)（圖3）。

圖3 菌株CSR-2對(duì)禾谷鐮孢分生孢子萌發(fā)的影響（比例尺=10 μm）Fig.3 Effects of CSR-2 on conidial germination of F.graminearum（scale=10 μm）

菌株CSR-2發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮孢分生孢子的影響結(jié)果表明，菌株CSR-2發(fā)酵液與禾谷鐮孢分生孢子處理4 h時(shí)，對(duì)照組分生孢子萌發(fā)率為84.31%，3個(gè)處理組（OD600＝0.15、0.3和0.6）分生孢子的萌發(fā)率分別為59.22%、8.33%及7.14%。隨著菌株CSR-2發(fā)酵液濃度增加，禾谷鐮孢分生孢子萌發(fā)率逐漸降低，推測(cè)菌株CSR-2產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物能破壞禾谷鐮孢分生孢子的結(jié)構(gòu)從而抑制孢子萌發(fā)（圖4）。

圖4 不同濃度的CSR-2對(duì)禾谷鐮孢分生孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of different concentrations CSR-2 on the conidia germination of F.graminearum

2.3 菌株CSR-2田間試驗(yàn)結(jié)果

在無(wú)藥劑處理的陰性對(duì)照組，玉米莖腐病的病情指數(shù)為78.9；2%戊唑醇懸浮種衣劑進(jìn)行種子包衣的病情指數(shù)為38.9，防治效果為50.7%；生防菌CSR-2處理組病情指數(shù)為37.1，病害防治效果為52.3%，表明CSR-2可顯著降低玉米莖腐病的田間發(fā)病率（表1）。

表1 菌株CSR-2對(duì)玉米莖腐病的田間防治效果Table 1 Biocontrol effect of strain CSR-2 against maize stalk rot in field trials

2.4 菌株CSR-2全基因組測(cè)序結(jié)果

2.4.1 基因組測(cè)序與組裝 采用三代 PacBio測(cè)序技術(shù)進(jìn)行CSR-2全基因組測(cè)序，共獲得198692條高質(zhì)量的長(zhǎng)片段，基因組測(cè)序深度為395.83 X，N50大小為9082 bp。采用Microbial Assembly、HGAP4軟件和Canu（v1.6）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝結(jié)果表明，菌株CSR-2基因組由3202366 bp的單條環(huán)狀染色體組成，GC含量為 59.11%?；?GC含量、GC偏差、tRNA/rRNA、COG注釋、堿基修飾和限制性修飾系統(tǒng)相關(guān)酶等信息構(gòu)建基因組圈圖，全基因組測(cè)序結(jié)果已登錄到GenBank，收錄號(hào)為CP081941（圖5）。

圖5 菌株CSR-2基因組圈圖Fig.5 Circular genome map of strain CSR-2

2.4.2 編碼基因的注釋及菌株鑒定 采用軟件Glimmer（v3.02）在菌株CSR-2中鑒定出3007個(gè)編碼基因，編碼基因總長(zhǎng)為2837892 bp，平均長(zhǎng)度為943.76 bp，編碼基因占全基因組序列的88.62%，其中含有62個(gè)tRNAs、15個(gè)rRNAs和14個(gè)其他RNA序列。使用trf409.legacylinux64軟件鑒定出串聯(lián)重復(fù)序列 97個(gè)，簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列29個(gè)。

利用NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列相似性搜索結(jié)果顯示，共有2743個(gè)基因被注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，占總數(shù)的91.22%。菌株CSR-2基因組的NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋排名前10的物種分布如圖6所示，相似性最高的是朝井桿菌屬，在菌株CSR-2的編碼基因中共注釋到810個(gè)編碼基因，占總數(shù)的29.53%，總量最大；其次為茂物朝井桿菌Asaiabogorensis注釋了739個(gè)基因，占比為26.94%。對(duì)5株朝井桿菌屬細(xì)菌的全基因組序列的ANI分析表明，菌株CSR-2與茂物朝井桿菌NBRC 16594（GenBank收錄號(hào)為AP014690.1）ANI值最高（80.09%），與朝井桿菌屬的暹羅朝井桿菌A.siamensis、桔梗朝井桿菌A.platycodi、夏枯草朝井桿菌A.prunellae和落新婦朝井桿菌A.astilbis的ANI值在79.12%～77.39 %，表明CSR-2與茂物朝井桿菌基因組相似度最高。利用NT數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菌株CSR-2染色體序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明，該菌株與茂物朝井桿菌NBRC 16594相似度最高。結(jié)合ANI分析及NR、NT數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，菌株CSR-2被鑒定為茂物朝井桿菌。

圖6 菌株CSR-2基因組的NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋前十物種分布圖Fig.6 Top-hit species distribution in the BLASTx analysis against the NR database of strain CSR-2 genome

3 討論

本研究從玉米根際土壤中分離到對(duì)禾谷鐮孢、稻瘟菌等7種植物病原真菌均有顯著抑制效果的細(xì)菌菌株CSR-2，田間試驗(yàn)表明該菌株對(duì)禾谷鐮孢引起的玉米莖腐病有顯著的防治效果。為深入挖掘CSR-2生防潛力及次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，本研究采用三代PacBio測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株CSR-2進(jìn)行全基因組測(cè)序和分析。第三代PacBio測(cè)序技術(shù)能夠?qū)蝹€(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，并開(kāi)發(fā)了用于三代測(cè)序的一些基因組裝軟件，讀段更長(zhǎng)，準(zhǔn)確率更高，極度敏感且無(wú)GC偏向性。自antiSMASH在線(xiàn)工具發(fā)布以來(lái)，全基因組序列信息在挖掘次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[24]。通過(guò)全基因組測(cè)序、ANI值分析以及NR、NT數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，菌株CSR-2被鑒定為茂物朝井桿菌。

醋酸菌（Acetic acid bacteria，AAB）是以氧氣為終端電子受體，氧化糖類(lèi)、糖醇類(lèi)和醇類(lèi)生成相應(yīng)的糖醇、酮和有機(jī)酸的革蘭氏陰性細(xì)菌的總稱(chēng)。已報(bào)道的醋酸菌共16個(gè)屬，84個(gè)種。隨著AAB種類(lèi)的增加，AAB的功能也逐漸被發(fā)掘，如產(chǎn)生纖維素、色素、吲哚乙酸、抗壞血酸和固氮等[25]。朝井桿菌屬是2000年被提出來(lái)的，以日本細(xì)菌學(xué)家Toshinobu Asai命名，該屬的典型菌種為茂物朝井桿菌[26]。

茂物朝井桿菌是首次從常綠喬木羊蹄甲Bauhiniapurpurea中分離出來(lái)的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，好氧、桿狀、具有鞭毛，屬于醋酸桿菌科朝井桿菌屬[26]。該菌常棲息于熱帶植物的花朵和果實(shí)中，能夠合成類(lèi)胡蘿卜素和類(lèi)異戊二烯醌等物質(zhì)，促進(jìn)其適應(yīng)于不同的生長(zhǎng)環(huán)境[27-29]。研究發(fā)現(xiàn)，該菌能產(chǎn)生許多胞外聚集物，具有粘附性，生物膜穩(wěn)定性強(qiáng)，具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，能在多種不同的環(huán)境中生長(zhǎng)。Grogan等[30]搜索了茂物朝井桿菌SF2.1全基因組序列，尋找該菌株細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位信號(hào)序列，并將其與報(bào)告蛋白堿性磷酸酶相融合，其中有3個(gè)信號(hào)肽能夠釋放抗菌肽類(lèi)物質(zhì)。利用蚊子進(jìn)一步測(cè)試表明，這3株茂物朝井桿菌菌株能夠產(chǎn)生抑制由寄生蟲(chóng)引起的瘧疾[31]。上述研究表明茂物朝井桿菌次生代謝產(chǎn)物豐富，適應(yīng)性強(qiáng)，能夠產(chǎn)生多種抗菌性物質(zhì)，但有關(guān)該菌株的研究和報(bào)道很少，尤其是有關(guān)茂物朝井桿菌對(duì)植物病原菌抑制作用的研究報(bào)道。

本研究表明菌株CSR-2影響禾谷鐮孢菌絲生長(zhǎng)和菌絲形態(tài)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵液處理的禾谷鐮孢分生孢子在4 h時(shí)萌發(fā)率降低了77.17%，推測(cè)菌株CSR-2產(chǎn)生的抑菌性物質(zhì)分泌到細(xì)胞外，拮抗病原真菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，有關(guān)菌株CSR-2次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定試驗(yàn)還在進(jìn)行中。將該菌株與玉米膜下滴灌水肥藥一體化相結(jié)合的田間試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株CSR-2對(duì)玉米莖腐病的防效顯著，且略高于2%戊唑醇懸浮種衣劑，可能與種衣劑在玉米灌漿前期效果減弱有關(guān)。如果將生防菌與種衣劑聯(lián)合施用，可能對(duì)玉米莖腐病的防治效果更好。本研究報(bào)道了茂物朝井桿菌CSR-2的生物防治作用，進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定和分析，并將生防菌與膜下滴灌水肥藥一體化體系相結(jié)合，為進(jìn)一步挖掘微生物資源及其代謝產(chǎn)物基因簇用于農(nóng)業(yè)生物防治提供理論依據(jù)。關(guān)于該菌株的代謝產(chǎn)物分析，生物防治機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。