薛 鳴，戰(zhàn) 鑫，王 睿，邢夢玉，劉 銅*，侯巨梅

（1.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228；2.海南省農(nóng)用生物制劑創(chuàng)制工程研究中心，?？?570228）

巴西橡膠樹Heveabrasiliensis是屬于大戟科橡膠樹屬的植物，原產(chǎn)于亞馬遜森林。在中國，橡膠樹主要分布于海南、廣東、廣西、福建、云南等地區(qū)[1]。天然橡膠廣泛運(yùn)用于工業(yè)、國防、交通等方面，是重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備資源，同時(shí)橡膠林也屬于熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)環(huán)境調(diào)節(jié)及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有重要意義。在橡膠種植過程中，由多主棒孢菌Corynesporacassiicola引起的橡膠樹棒孢霉落葉病是橡膠樹的毀滅性病害之一，該病害可造成膠乳減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可造成植株生長遲緩，整株死亡[2,3]。由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的橡膠炭疽病是一種重要的葉部病害，在橡膠種植區(qū)普遍發(fā)生[4-6]。目前生產(chǎn)上主要采用化學(xué)藥劑來防治這兩種病害，但是化學(xué)藥劑對(duì)土壤和生態(tài)環(huán)境有較大的影響，所以開發(fā)一種安全、綠色的防治方法將有助于橡膠產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展[7-9]。

木霉是一種廣泛存在于土壤中的生防微生物，通過產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物和細(xì)胞壁降解酶等抑制病原菌的生長[11,12]，同時(shí)可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。目前，國內(nèi)外開發(fā)的木霉制劑已經(jīng)應(yīng)用于各類植物病害的防治，但對(duì)于橡膠樹膠孢炭疽病和棒孢霉落葉病的防治作用卻鮮有報(bào)道[13]。本文擬從橡膠園根際土壤中分離，以期獲得拮抗兩種病原菌的木霉，為防治這兩種橡膠樹病害提供具有生防潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

引起橡膠炭疽病的膠孢炭疽菌由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院林春花教授贈(zèng)惠，引起橡膠棒孢霉落葉病的多主棒孢霉由海南大學(xué)木霉菌課題組保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水定容至1 L。PD培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水定容至1 L。PDAm培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂15 g，玫瑰紅0.02 g，定容到1 L，121 ℃滅菌冷卻后加入氯霉素0.1 g，鏈霉素0.3 g。CMD培養(yǎng)基：玉米粉30 g，葡萄糖18 g，瓊脂18 g，水定容至1 L。SNA培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，KCl 10.5 g，KNO31.0 g，MgSO40.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂18 g，水定容至1 L。木霉幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基：稱取粉末狀幾丁質(zhì)0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，KH2PO40.2 g，NH4NO30.3 g，蒸餾水定容至100 mL。DNS溶液：酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水中，加熱后在溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸0.63 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，室溫避光保存。

1.2 拮抗木霉分離

2020年9月12日，在海南儋州那大橡膠園（19°25′53″ N，109°34′11″ E）采集橡膠樹根際土壤 16份，分別保存在塑封袋并置于冰盒中，當(dāng)天轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)室保存于4 ℃?zhèn)溆?。木霉分離采用稀釋平板法進(jìn)行，具體操作如下：取10 g根際土樣放入無菌三角瓶中，加入90 mL ddH2O，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min后靜置，取上清液稀釋100倍，然后取稀釋液0.2 mL均勻涂布PDAm平板，于28 ℃黑暗培養(yǎng)2 d后，觀察是否有菌落長出，挑選單一菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，將疑似木霉挑出與純化，保存4 ℃冰箱備用。

1.3 對(duì)峙培養(yǎng)與拮抗系數(shù)測定

將木霉菌株、膠孢炭疽菌和多主棒孢菌轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，用打孔器（φ＝5 mm）沿菌絲邊緣切下菌餅，分別將木霉菌餅與病原菌菌餅對(duì)稱接種到平板PDA培養(yǎng)基兩側(cè)，中間相距5 cm，以只接病原菌為對(duì)照，于28 ℃培養(yǎng)10 d后，測量病原菌菌落半徑，計(jì)算抑制率，抑制率（%）＝(對(duì)照菌落半徑－處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑×100。拮抗系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]：Ⅰ級(jí)，木霉菌絲占平皿的100%；Ⅱ級(jí)，木霉菌絲占平皿的 2/3 以上；Ⅲ級(jí)，木霉菌絲占平皿的 1/3～2/3；Ⅳ級(jí)，木霉菌絲占平皿的1/3以下；Ⅴ級(jí)，病原菌絲占平皿的100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 非揮發(fā)性物質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用

將木霉菌株活化5 d后，利用無菌水稀釋成含量為1×108孢子/mL的分生孢子懸浮液，取100 μL分生孢子懸浮液接種在100 mL PD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，發(fā)酵液8000 r/min離心2 min。取上清液用0.22 μm無菌濾膜過濾，收集過濾液，取10 mL木霉過濾液與40 mL熔化的PDA培養(yǎng)基混合倒平板，以10 mL無菌水和40 mL熔化的PDA培養(yǎng)基混合倒平板為對(duì)照。待平板凝固后，分別在含過濾液培養(yǎng)基和對(duì)照平板中央接種病原菌，待菌落生長4 d后用十字交叉法測量病原菌的菌落半徑，計(jì)算木霉非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的拮抗作用，抑制率計(jì)算公式同1.2.1，試驗(yàn)重復(fù)3次。

采用對(duì)扣培養(yǎng)法測定揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制作用[15]。將木霉接種在PDA培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后，揭去皿蓋，在上方覆蓋一張無菌玻璃紙（直徑大于培養(yǎng)皿），將另一個(gè)大小一致中心接種病原菌的平板（去蓋）對(duì)扣在木霉培養(yǎng)基上方，用封口膜封閉，以不接種木霉的對(duì)扣為空白對(duì)照。培養(yǎng)4 d后，用十字交叉法測量病原菌的菌落半徑，計(jì)算抑制率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 幾丁質(zhì)酶活測定

膠態(tài)幾丁質(zhì)制備及幾丁質(zhì)酶活測定參照Berger和Rynolds[16]描述的方法，將10 g粉末狀幾丁質(zhì)置于研缽中，少量多次加入4 ℃預(yù)冷濃鹽酸，研磨呈糊狀，置于4 ℃靜置24 h。將靜置好的幾丁質(zhì)用紗布過濾，濾液用蒸餾水?dāng)嚢柘♂專?000 r/min離心10 min后去上清，如此反復(fù)至溶液pH呈中性，然后用蒸餾水定容至1000 mL。將搖培4 d的木霉發(fā)酵液經(jīng)三層紗布過濾，取5.0 mL濾液加入2.0 mL膠態(tài)幾丁質(zhì)，置于37 ℃保溫3 h后，取2.0 mL濾液加入1.5 mL DNS、1.0 mL緩沖液，沸水浴10 min，冷水冷卻至室溫，用540 nm比色測定OD值。以100 ℃滅活10 min的酶液為空白對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。以1.0 mL粗酶液每1 h分解膠態(tài)幾丁質(zhì)產(chǎn)生l μmol還原糖（N-乙酰氨基葡萄糖）的酶量定義為一個(gè)酶單位（U）。

1.6 木霉形態(tài)特征觀察

將木霉分別轉(zhuǎn)接于PDA、CMD、SNA培養(yǎng)基上，于26 ℃下黑暗培養(yǎng)，每隔24 h觀察菌株在3種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、生長速度、顏色和色素等特征，進(jìn)行拍照記錄。

1.7 木霉分子鑒定

采用CTAB法提取木霉菌絲DNA，以引物EF-1728F 5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和TEFRg 5′-GCCATCCTTGGGAGATACCAGC-3′擴(kuò)增基因tef-1α（translation elongation factor 1 alpha）片段；以引物rpb2-5f：5′-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3′和 rpb2-7cr：5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′擴(kuò)增基因rpb2（RNA polymerase B subunit II）片段[17,18]。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶后連接至T載體，送至上海生工公司進(jìn)行測序。將獲得tef-1α以及rpb2序列采Snapgene軟件切除質(zhì)量較低序列，通過Blast在線（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與在GenBank中的基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，從GenBank中獲取不同木霉菌的tef-1α和rpb2序列，采用MEGA10對(duì)tef-1α-rpb2序列拼接后，以鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，用 Bootstrap 對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1000次重復(fù)[19]。

1.8 室內(nèi)防效測定

將膠孢炭疽菌和多主棒孢菌分別在PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)3 d后，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊，接種在含有100 mL PD的250 mL三角瓶中，在28 ℃光照250 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后, 用滅菌擦鏡紙過濾菌絲，獲得病原菌孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度為1×108孢子/mL。

選取大小一致的橡膠感病品種文昌 11的古銅色嫩葉，用濕潤棉球擦拭干凈表面，采用滅菌的針頭在橡膠葉片表面劃出輕微傷口，用木霉孢子懸浮液對(duì)葉片表面均勻噴灑，待葉片自然晾干0.5 h后，在傷口處接種10 μL病原菌孢子懸浮液（1×108孢子/mL），將葉片放入鋪有潤濕紗布的保鮮盒內(nèi)，于28 ℃保濕培養(yǎng)72 h后，觀察發(fā)病情況并拍照記錄。以未經(jīng)木霉處理，只接種病原菌為對(duì)照。使用軟件IMAGE J（Wayne Rasband，National Institute of Health，USA），測量病斑面積，與對(duì)照相比，計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（對(duì)照組面積—處理組面積）/對(duì)照組面積×100。每個(gè)處理選取30個(gè)病斑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用EXCEL和SPSS 20.0 Graph PadsPrism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Adobe PhotoShop CS 6進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗木霉的分離與拮抗

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，從16份橡膠根際土壤中分離獲得6株拮抗木霉。通過對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所有木霉對(duì)膠孢炭疽菌和多主棒孢菌病原菌有一定的抑制作用，其抑制率分別為 76.73%～86.16%和 58.33%～76.67%；其中T139和T008分別對(duì)膠孢炭疽菌和多主棒孢菌抑制率最高，為86.16%和76.67%；T139對(duì)多主棒孢菌抑制率最低，僅為58.33%；通過拮抗系數(shù)測定，T008、T023、T139和T235對(duì)兩種病原菌的拮抗系統(tǒng)為Ⅰ級(jí)，表明具有較強(qiáng)的拮抗作用（表1，圖1）。

圖1 6株木霉對(duì)橡膠樹兩種病原菌拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of 6 isolates of Trichoderma on two pathogens of rubber tree

表1 6株木霉對(duì)橡膠樹兩種病原菌生長抑制率及拮抗系數(shù)Table 1 Growth inhibition rates of 6 isolates of Trichoderma against two pathogens of rubber tree

2.2 非揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)兩種病原菌的抑制作用

6株木霉的非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)2種病原菌均有一定抑制作用，但同株木霉對(duì)不同病原菌的抑制作用有明顯差異。所有木霉的發(fā)酵液對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率為30.30%～57.58%，對(duì)多主棒孢菌抑制率為33.33%～61.54%；其中菌株T017和T139的發(fā)酵液分別對(duì)膠孢炭疽菌和多主棒孢菌抑制作用最強(qiáng)，分別為57.58%和61.54%；通過對(duì)扣培養(yǎng)法測定6株木霉所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)2種病原菌的生長有一定的抑制作用，其抑制率為4.08%～35.71%；其中菌株T008對(duì)2種病原菌的抑制率最高，分別為16.33%和30.77%； 菌株T139對(duì)兩種病原菌的抑制率最低，分別為4.08%和11.54%（表2）。

表2 6株木霉非揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)兩種病原菌的抑制率（%）Table 2 Inhibitory rate of non-volatile substance and volatile substances from 6 isolates of Trichoderma on two pathogens (%)

2.3 幾丁質(zhì)酶活性

6株木霉幾丁質(zhì)酶活性測定的結(jié)果表明，6株木霉的幾丁質(zhì)酶介于0.85～1.85 U，不同木霉之間產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活差異較大，其中菌株T235、T023、T027和T008有較高的幾丁質(zhì)酶活性，分別為1.84、1.51、1.41和1.39 U；菌株T017產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活最低，僅為0.85 U（圖2）。結(jié)合抑制結(jié)果，選菌株T008進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 6株木霉幾丁質(zhì)酶活性Fig.2 Chitinase bioactivity from 6 isolates of Trichoderma

2.4 拮抗木霉T008的鑒定

木霉T008在PDA培養(yǎng)基可以生長迅速，3 d后可長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，菌落呈放射狀，氣生菌絲豐富，分生孢子大量形成；菌株初期呈白色，后期呈黃綠色至綠色。在CMD培養(yǎng)基上產(chǎn)生產(chǎn)孢簇，分生孢子形成于同心圓內(nèi)，顏色呈深綠色；在SNA培養(yǎng)基上分生孢子較少，并聚集在同心圓上，淺綠色；在3種培養(yǎng)基上均無色素和特殊氣味產(chǎn)生，菌絲分支常常對(duì)生，偶爾單生，呈塔狀，瓶梗單生或2～4個(gè)輪生，孢子梗呈燒瓶形，分生孢子近圓形、光滑、深綠色（圖3）。綜上可知，木霉T008形態(tài)特征與棘孢木霉一致[20]。

圖3 木霉T008形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological charcterization of Trichoderma T008

木霉T008 基因tef-1α和rpb2經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得563和1024 bp的片段，GenBank登錄號(hào)分別為MW813956和MZ361841；通過Blast與GenBank中已有的序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果顯示菌株T008與已知棘孢木霉TRS705、TRS741、TRS742、TRS744和TRS746同屬一分支（圖4）。結(jié)合形態(tài)特征結(jié)果，木霉T008被鑒定為棘孢木霉。

圖4 基于基因tef-1α和rpb2構(gòu)建的木霉T008系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of Trichoderma T008 based on gene tef-1α and rpb2

2.5 棘孢木霉T008對(duì)兩種病原菌的室內(nèi)防效

棘孢木霉 T008的室內(nèi)防效試驗(yàn)結(jié)果表明，通過棘孢木霉 T008孢子懸浮液預(yù)處理橡膠葉片后，分別接種膠孢炭疽菌和多主棒孢菌后，其病斑面積分別為 0.28和 0.13 cm2，而對(duì)照發(fā)病面積分別為0.44（只接種膠孢炭疽菌）和0.22 cm2（只接種多主棒孢菌）（圖5a，b），抑制率分別為61.02%和58.60%，表明棘孢木霉 T008對(duì)兩種病害有較好的預(yù)防作用（表3）。

表3 棘孢木霉T008對(duì)橡膠樹兩種病害室內(nèi)防效測定Table 3 Indoor control effect of T.asperellum T008 on two diseases of rubber tree

圖5 棘孢木霉T008對(duì)橡膠樹兩種病害葉片發(fā)病情況Fig.5 Incidence of T.asperellum T008 on two diseases of rubber tree

3 討論

木霉生長速度快，在其生長過程中可產(chǎn)生一些抗生物質(zhì)抑制病原菌的生長[21]。吳利民等[22]通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出對(duì)黃瓜褐斑病菌具有較好抑制效果的木霉TR-12。通過對(duì)峙培養(yǎng)法，可以直接、有效地篩選出對(duì)靶標(biāo)菌具有較好拮抗效果的菌株。李紀(jì)順等[23]通過平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選出對(duì)西洋參立枯病菌抑制率達(dá)99.33%的木霉，羅紅霞等[24]篩選出9株對(duì)柑橘青霉病菌有較好的抑制效果的木霉。本試驗(yàn)通過平板對(duì)峙培養(yǎng)法從6株木霉中獲得了對(duì)橡膠樹兩種病原菌都有較強(qiáng)抑制作用的菌株T139和T008。

研究報(bào)道木霉還可以產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，可以抑制病原菌生長。趙玳琳等[25]測定了棘孢木霉GYSW-6m1發(fā)酵液對(duì)草莓炭疽病菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)草莓炭疽病菌在木霉代謝產(chǎn)物平板上培養(yǎng)3、5和7 d時(shí)，生長受到明顯抑制。楊帥等[26]通過棘孢木霉的發(fā)酵液處理番茄早疫病病原菌，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液降低了番茄防御酶的量，并且增加氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，從而抑制了番茄早疫病病原菌的生長，本研究通過發(fā)酵液抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)6株木霉的發(fā)酵液對(duì)兩種病原菌同樣有一定的抑制作用，其中T017對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率達(dá)到57.58%，說明該菌株可能產(chǎn)生高活性的抑制膠孢炭疽菌的次生代謝產(chǎn)物，但具體是哪些代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用尚不清楚，還有待于進(jìn)一步的研究。木霉同時(shí)能夠產(chǎn)生豐富的易揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)病原菌產(chǎn)生一定的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)木霉T008產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)兩種病原菌有較高的的抑制作用，但是菌株 T139對(duì)兩種病原菌的抑制效果較差。這也說明了不同種木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性抑菌物質(zhì)種類與數(shù)量有不同，從而導(dǎo)致對(duì)病原體菌絲抑制效果相差較大。

木霉可以產(chǎn)生一些細(xì)胞壁降解酶，如幾丁質(zhì)酶可以裂解真菌的幾丁質(zhì)和幾丁寡聚物等物質(zhì)，溶解真菌細(xì)胞壁，抑制病原菌的生長[27]。本試驗(yàn)通過幾丁質(zhì)酶活測定，發(fā)現(xiàn)T235可以產(chǎn)生較高的幾丁質(zhì)酶活性，但在對(duì)峙培養(yǎng)中沒有表現(xiàn)出最好的抑菌效果，這可能由于木霉 T235的生長速率較慢所導(dǎo)致。通過以上研究表明，不同木霉對(duì)不同病原菌的抑菌活性存在差異，因此在橡膠病害綜合防治中可考慮使用木霉菌混合菌劑，彌補(bǔ)單一木霉制劑的不足。

真菌傳統(tǒng)鑒定方法主要以菌株在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、分生孢子及孢子梗等形態(tài)特征為依據(jù)，但由于培養(yǎng)環(huán)境的不同，一些真菌的菌落形態(tài)和某一些微觀特征發(fā)生變化，因此完全從形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定會(huì)導(dǎo)致不準(zhǔn)確[28]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子手段鑒定真菌越來越普遍，如林春花等[29]通過多基因序列法，鑒定了海南省橡膠樹不同植膠地點(diǎn)的 16株炭疽菌，分析了海南橡膠炭疽病病原菌遺傳種群，并分析出引起橡膠炭疽病的病原菌主要類群暹羅炭疽菌Colletotrichumsiamense。木霉屬包括330多種，種與種之間的形態(tài)差異較小，很難從形態(tài)上完全區(qū)分不同的種，研究報(bào)道以tef-1α和rpb2保守基因可較好鑒定不同木霉種[30]。因此，本研究通過形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定了T008為棘孢木霉。

經(jīng)室內(nèi)離體防效測定，發(fā)現(xiàn)棘孢木霉T008孢子懸浮液處理后的橡膠葉片，顯著減少了葉片病斑面積，表明木霉可能在橡膠葉片上萌發(fā)，對(duì)橡膠炭疽菌和多主棒孢菌產(chǎn)生競爭，重寄生及誘導(dǎo)抗病性的作用，從而抑制了病害的發(fā)生。Pujade-Renaud等[31]從橡膠樹中分離出內(nèi)生真菌康氏木霉，證明了該菌株能夠定殖于橡膠樹內(nèi)，并且對(duì)多主棒孢菌有較強(qiáng)的抑制效果。