李英，趙暉，王躥躥，南岳，王東，杜新平

（天津市第五中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，天津300450）

腦組織缺血再灌注導(dǎo)致的損傷是心臟驟停（cardiac arrest,CA）后死亡的首要病因[1]。然而到目前為止，尚無(wú)藥物能有效改善其預(yù)后。有研究表明，腦組織缺血再灌注后可導(dǎo)致氧自由基生成、鈣超載、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，并且進(jìn)一步導(dǎo)致腦神經(jīng)元細(xì)胞死亡[2-3]。褪黑素是由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有降低氧自由基、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用。多項(xiàng)動(dòng)物研究結(jié)果顯示，褪黑素通過其抗氧化活性可有效減輕腦、腎等器官的缺血/再灌注損傷[4-6]。然而，褪黑素是否能夠通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并緩解CA、心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation,CPR）后腦缺血/再灌注損傷尚未見報(bào)道。本研究擬復(fù)制小鼠CA 后CPR 誘導(dǎo)的腦損傷模型，通過褪黑素藥物干預(yù)，探討其作用及作用機(jī)制，以期為臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

44 只健康、雄性、成年、體重18～24 g 的BALB/c 小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2021-0013，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0050，購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（8 只）、模型組（18 只）、褪黑素組（18 只）。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案均嚴(yán)格按照醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范執(zhí)行。

1.2 主要設(shè)備與試劑

體視顯微鏡（SANQTID 8-50X） 購(gòu)自深圳市三鏘泰達(dá)光學(xué)儀器有限公司，生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（MADLAB-4C/501H 型） 購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，呼吸機(jī)購(gòu)自河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣振華教學(xué)儀器有限公司。褪黑素（C10260299）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，肝素（EHJID-HEP001）購(gòu)自浙江惠嘉生物科技有限公司，氯化鉀（10016308）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鹽酸腎上腺素（200116）購(gòu)自寧波第二激素廠，丙二醛（Malondialdehyde,MDA）檢測(cè)試劑盒（K739-100）購(gòu)自美國(guó)Biovision 公司，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性檢測(cè)試劑盒（KGT02424）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，兔抗小鼠一抗GRP78（#3177）、Chop（#3177）、PERK（#3192）、eIF2α（#5324）、p-eIF2α（#3398）、ATF4（#11815）、β-actin（#4970）、山羊抗兔二抗（#7074）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，p-PERK（bs-3330R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物準(zhǔn)備與模型復(fù)制小鼠手術(shù)前夜禁食，可自由飲水。術(shù)前稱重，使用異氟烷吸入麻醉后氣管插管，接入呼吸機(jī)，異氟烷維持濃度為1.5%，吸入氧濃度30%、氮?dú)?0%，固定小鼠，并記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ導(dǎo)聯(lián)心電圖，將測(cè)溫探頭置于顳肌，加溫頭部至37.5℃，并維持10 min。剔除右側(cè)胸前區(qū)和右腹股溝區(qū)鼠毛，先后予以乙醇和絡(luò)合碘消毒。消毒后以右側(cè)胸鎖關(guān)節(jié)為中心斜下、右腹股溝沿大腿切開0.7～1.0 cm，分離頸外靜脈、股動(dòng)脈。于股動(dòng)脈置入PE10 管，并接入血壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)血壓，于頸外靜脈置入PE10 管（PE 管預(yù)充1%肝素鹽水）。PE10 管連接于充有50 μL 1%肝素的注射器。置管后注射25 μL 1%肝素，隨后抽吸300～350 μL 血液。待腦溫達(dá)37.5℃后迅速注射30 μ L 0.5 mol/L 氯化鉀，關(guān)閉呼吸機(jī)、麻醉藥物、氮?dú)猓瑢⒀鯕鉂舛日{(diào)至100%。心臟驟停2 min 后將先前抽取的血液1 min 內(nèi)注射進(jìn)小鼠體內(nèi)。小鼠心臟驟停7 min 30 s 后緩慢靜脈泵入3.2%腎上腺素（1.2 mL/h）。小鼠心臟驟停8 min 時(shí)打開呼吸機(jī)，心臟按壓（300 次/min），靜脈快速泵入3.2%腎上腺素100 μL 后繼續(xù)以1.2 mL/h 速度持續(xù)靜脈泵入。自主循環(huán)恢復(fù)后停止按壓，繼續(xù)靜脈泵入3.2%腎上腺素50 μL，自主循環(huán)恢復(fù)10 min后將吸入氧氣濃度調(diào)整為50%、氮?dú)鉂舛日{(diào)整為50%，30 min 后關(guān)閉呼吸機(jī)、氧氣、氮?dú)?，并放置于鼠籠恢復(fù)。心臟按壓2 min 30 s 尚未恢復(fù)自主循環(huán)視為復(fù)蘇失敗，作為排除標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程維持腦溫37.5℃。因股動(dòng)脈穿刺術(shù)后小鼠右下肢癱瘓，無(wú)法進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，各組選取5 只測(cè)定血壓，其余不進(jìn)行血壓監(jiān)測(cè)。假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備同上。待腦溫達(dá)到37.5℃、吸入氧濃度調(diào)至100%時(shí)，不予以注射腎上腺素。待18 min后將吸入氧氣濃度調(diào)整為50%、氮?dú)鉂舛日{(diào)整為50%，38 min 后撤股動(dòng)脈管、縫合皮膚，關(guān)閉呼吸機(jī)、氧氣、氮?dú)?，置于鼠籠恢復(fù)。假手術(shù)組不予任何處理。褪黑素組于術(shù)前30 min 腹腔注射褪黑素（10 mg/kg），術(shù)后第2 天開始以同樣劑量腹腔注射，2 次/d。模型組注射1%乙醇鹽水，注射時(shí)間和方式同褪黑素組。

1.3.2 神經(jīng)功能評(píng)分各組小鼠心臟驟停后第3 天進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定。神經(jīng)功能評(píng)分采用9 分法[7]，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：將小鼠放置在10 cm×20 cm 的水平網(wǎng)格狀屏幕上（網(wǎng)格大小為0.2 cm×0.2 cm），并旋轉(zhuǎn)到垂直90°，記錄小鼠能夠黏附在垂直屏幕上的時(shí)間，持續(xù)≥15 s 計(jì)3 分。接下來(lái)，將小鼠放在一根水平木棒（直徑1.5 cm）的中心，并記錄小鼠在木棒上保持平衡的時(shí)間，持續(xù)≥30 s 計(jì)3 分。最后進(jìn)行牽拉試驗(yàn)，測(cè)定小鼠能抓住水平繩子的時(shí)間，>5 s 計(jì)3 分。9 分為正常，0 分為嚴(yán)重神經(jīng)功能損傷。

1.3.3 小鼠存活率評(píng)估心臟驟停后第10 天觀察小鼠的死亡情況，計(jì)算存活率。

1.3.4 Western blottingWestern blotting 檢測(cè)小鼠腦組織GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、Chop 蛋白相對(duì)表達(dá)量。心臟驟停后6 h 取各組小鼠全腦，各組剪取適當(dāng)大小腦組織加入到裂解液中裂解，裂解完后4℃、12 000 r/min離心5 min，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果對(duì)蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整。取等量蛋白樣品依次進(jìn)行8% SDSPAGE 電泳和轉(zhuǎn)膜，隨后室溫?fù)u床封閉2 h。分別加入相應(yīng)一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，再用二抗（1∶2000）37℃搖床孵育2 h。以β-actin 作為內(nèi)參，ECL顯色曝光、照相，采用Image J 軟件處理圖像，計(jì)算目標(biāo)蛋白與β-actin 灰度比值。

1.3.5 LDH、MDA測(cè)定心臟驟停術(shù)后6 h 取動(dòng)脈血500 μL，靜置后離心取血清，檢測(cè)LDH 活性；取10 mg 腦組織，加入1 mL 的MDA 裂解液（已加入3 μL 100×BHT）勻漿，以13 000 r/min 離心10 min，取上清液，測(cè)定MDA 水平。樣品制備完成后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.6 海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞死亡檢測(cè)將實(shí)驗(yàn)所需組織放入4%多聚甲醛固定后，用分級(jí)濃度的乙醇脫水，二甲苯使其透明化，隨后組織浸蠟、包埋，并切成5 μm 厚的連續(xù)切片。切片用蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇浸泡3 s，伊紅復(fù)染3 min。最后將切片脫水，并固定于顯微鏡下觀察、拍照，統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用Monte Carlo 近似法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般資料比較

小鼠均復(fù)蘇成功。各組小鼠體重、心率、平均動(dòng)脈壓、胸外按壓時(shí)間、腎上腺素用量、自主呼吸恢復(fù)時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組小鼠一般資料比較（±s）

表1 各組小鼠一般資料比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組褪黑素組F/t 值P 值n8 18體重/g 20.1±2.2 21.2±2.2 21.1±2.0 0.818 0.448心率/（次/min）540.0±21.3 544.5±19.1 541.2±15.1 0.192 0.826平均動(dòng)脈壓/mmHg 76.1±3.2 76.4±4.5 75.1±2.5 0.541 0.586胸外按壓時(shí)間/s-87.4±32.1 78.1±25.0 0.940 0.354腎上腺素用量/μL-263.1±39.4 264.3±41.2 0.075 0.941 18自主呼吸恢復(fù)時(shí)間/s-413.1±68.2 390.2±62.2 1.060 0.296

2.2 褪黑素對(duì)小鼠存活率的影響

模型組術(shù)后第5、7 及8 天分別死亡1 只，10 d生存率為70%，褪黑素組第9 天死亡1 只，10 d 生存率為90%，假手術(shù)組小鼠10 d 內(nèi)無(wú)死亡情況。各組小鼠術(shù)后10 d 生存率比較，經(jīng)Monte Carlo 近似法檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.286）。

2.3 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較

假手術(shù)組、模型組、褪黑素組神經(jīng)功能評(píng)分分別為（8.91±0.08）分、（4.40±0.97）分、（6.20±0.63）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=115.012，P=0.005），模型組較假手術(shù)組低（P<0.05），褪黑素組較模型組高（P<0.05）。表明褪黑素能夠緩解CA 引起的腦神經(jīng)功能損傷。

2.4 各CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞死亡數(shù)量比較

假手術(shù)組、模型組、褪黑素組CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞死亡數(shù)量分別為（9.05±1.84）個(gè)/Hp、（22.11±3.28）個(gè)/Hp、（15.35±3.50）個(gè)/Hp，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.340，P=0.0037），模型組較假手術(shù)組多（P<0.05），褪黑素組較模型組少（P<0.05）。見圖1。

2.5 各組LDH活性、MDA水平比較

各組LDH 活性、MDA 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型組較假手術(shù)組高（P<0.05），褪黑素組較模型組低（P<0.05）。提示褪黑素能夠緩解CA/CPR 引起的腦神經(jīng)損傷。見表2。

表2 各組LDH活性、MDA水平比較（±s）

表2 各組LDH活性、MDA水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組褪黑素組F 值P 值LDH活性/（u/L）466.35±32.98 641.63±42.34 519.56±35.55 17.540 0.003 MDA水平/（nmol/mg）3.99±0.40 12.59±0.81 7.39±1.11 82.430 0.000

2.6 各組腦組織GRP78、Chop、ATF4、p-eIF2α、p-PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組腦組織GRP78、Chop、p-PERK、p-eIF2α、ATF4 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型組較假手術(shù)組高（P<0.05），褪黑素組較模型組低（P<0.05）。見表3 和圖2。

圖2 腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 各組腦組織GRP78、Chop、ATF4、p-eIF2α、p-PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組腦組織GRP78、Chop、ATF4、p-eIF2α、p-PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組褪黑素組F 值P 值GRP78 0.26±0.05 0.93±0.04 0.57±0.04 190.400 0.000 Chop 0.37±0.02 0.78±0.03 0.56±0.03 192.500 0.000 ATF4 0.27±0.03 0.77±0.04 0.48±0.02 186.200 0.000 p-eIF2α 0.51±0.03 0.99±0.01 0.83±0.04 184.600 0.000 p-PERK 0.22±0.02 0.72±0.03 0.43±0.03 297.500 0.000

3 討論

目前公認(rèn)的心臟驟停后腦復(fù)蘇最有效的治療策略是腦部低溫治療，但是其療效十分有限。因此，探尋新的、有效的治療方法具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，褪黑素組神經(jīng)功能評(píng)分及腦海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞死亡檢測(cè)結(jié)果均顯著優(yōu)于模型組，3 組CA/CPR 后10 d 小鼠存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但褪黑素組小鼠存活率高于模型組，說明褪黑素對(duì)CA/CPR 后腦缺血/再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

褪黑素是松果體分泌的一種激素，具有高脂溶性，能通過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮作用[8]。多項(xiàng)研究表明，褪黑素具有很強(qiáng)的清除羥自由基和過氧自由基的作用，還可通過增加抗氧化酶的活性發(fā)抗氧化作用，是已知體內(nèi)最強(qiáng)的抗氧化成分之一[9]。目前認(rèn)為心臟驟停后腦缺血/再灌注損傷主要機(jī)制之一是氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。有趣的是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及PERKeIF2α-ATF4 信號(hào)通路與活性氧具有緊密的聯(lián)系，PERK-eIF2α-ATF4 信號(hào)通路參與清除氧自由基而達(dá)到抗氧化作用[11-12]。此外，有研究報(bào)道褪黑素可有效改善小鼠急性心肌缺血/再灌注損傷，其機(jī)制可能是通過抑制PERK-eIF2α-ATF4 信號(hào)通路從而減少細(xì)胞凋亡[13]，亦有研究結(jié)果顯示褪黑素可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮腦梗死后的腦保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠大腦GRP78、p-PERK、p-eIF2a、ATF4、Chop 蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著降低，褪黑素組較模型組降低，說明褪黑素可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)。

綜上所述，褪黑素對(duì)CA/CPR 后小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過抑制PERK-eIF2α-ATF4 信號(hào)通路，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕神經(jīng)損傷。