郭小剛， 羅培燕， 彭 雷

(重慶市黔江中心醫(yī)院 普外科， 重慶 409000)

兒童結(jié)腸息肉臨床常表現(xiàn)為間歇性無(wú)痛性鮮血樣便，疾病原因是結(jié)腸黏膜表面隆起并向腸內(nèi)突起[1-2]。研究顯示結(jié)腸息肉的進(jìn)展與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，息肉病變類型中腺瘤性息肉更易發(fā)生癌變[3]。因此，探尋結(jié)腸息肉疾病進(jìn)展中相關(guān)生物標(biāo)志物以監(jiān)測(cè)癌變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于阻斷和預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生有重要臨床價(jià)值。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是體內(nèi)固有免疫的組分，在炎癥反應(yīng)中有重要作用[4]。李瀟等[5]研究顯示，NLRP3在潰瘍型結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織中高表達(dá)。微小RNA-22-3p(microRNA-22-3p，miR-22-3p)與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移等密切相關(guān)[6]。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，NLRP3與miR-22-3p間存在靶向調(diào)控作用[7]，但二者在兒童結(jié)腸息肉中的作用仍缺乏研究。因此，本研究旨在探究NLRP3及miR-22-3p在結(jié)腸息肉疾病進(jìn)展中的表達(dá)分析兒童結(jié)腸息肉疾病進(jìn)展中的影響因素，為監(jiān)測(cè)結(jié)腸息肉疾病進(jìn)展提供可靠的臨床生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1對(duì)象 選取2019年11月—2021年5月住院治療的98例結(jié)腸息肉患兒，3～12歲，其中幼年性息肉52例、腺瘤性息肉46例，另選取相對(duì)應(yīng)患兒正常結(jié)腸組織作為對(duì)照，收集整理98例患兒性別、年齡、息肉部位、息肉數(shù)目、黏膜狀態(tài)及息肉直徑等臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)腸息肉經(jīng)內(nèi)鏡及病理檢查確診；(2)組織標(biāo)本完整、且臨床資料齊全；(3)入組前未進(jìn)行過(guò)術(shù)前治療，研究經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒或家屬均自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有先天性腸管畸形或家族性息肉病者；(2)哭鬧嚴(yán)重、不能配合完成實(shí)驗(yàn)者；(3)有腸道惡性腫瘤或其他部位惡性腫瘤者；(4)有肝腎功能不全者。

1.1.2主要試劑與儀器 免疫組化試劑盒(貨號(hào)XY--0022)購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，NLRP3抗體(貨號(hào)FNab10120)購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司，miRNA提取試劑盒(貨號(hào)AM1556)購(gòu)自美國(guó)Life公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)D1802)購(gòu)自?；锟萍加邢薰荆琒YBR Green RT-PCR Master Mix(貨號(hào)HY-K0521)購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，光學(xué)顯微鏡(型號(hào)CX23)購(gòu)自日本OLYMPUS公司，qRT-PCR儀(型號(hào)CFX96)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1樣品采集及保存 采集結(jié)腸息肉患兒術(shù)中正常結(jié)腸組織以及息肉組織、腺瘤性息肉組織，液氮保存待測(cè)。

1.2.2miR-22-3p表達(dá)水平檢測(cè) 按照試劑盒操作說(shuō)明提取組織總RNA并合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)總體積為20 μL：cDNA模板(50 mg/L)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR Green RT-PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O 8.0 μL，重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法(CT代表循環(huán)閾值)計(jì)算目的基因miR-22-3p的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)98例結(jié)腸息肉患兒miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量中位值(0.48)，將其分為miR-22-3p高表達(dá)49例、miR-22-3p低表達(dá)49例。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primers of qRT-PCR

1.2.3NLRP3蛋白水平測(cè)定 對(duì)各組織標(biāo)本進(jìn)行處理(采用40 g/L多聚甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋、連續(xù)切片)后，按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色(PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照)，之后每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野(10×40倍)觀察，并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，由3名人員獨(dú)立采用半定量法評(píng)判。首先按照陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞比例1/3以下計(jì)1分、1/3～2/3計(jì)2分、2/3以上計(jì)3分；然后按染色強(qiáng)度計(jì)分，棕褐色計(jì)3分、棕黃色計(jì)2分、淺黃色計(jì)1分、無(wú)著色計(jì)0分；兩次評(píng)分乘積為最終得分，≤2分為陰性表達(dá)、>2分為陽(yáng)性表達(dá)。根據(jù)98例結(jié)腸息肉患兒NLRP3蛋白表達(dá)情況，將其分為NLRP3陰性表達(dá)38例、NLRP3陽(yáng)性表達(dá)60例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NLRP3陽(yáng)性表達(dá)和miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量

與正常結(jié)腸組織比較，幼年性息肉組織、腺瘤性息肉組織中NLRP3陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 NLRP3陽(yáng)性表達(dá)和miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量Tab.2 Comparison of NLRP3 positive expression and relative expression of miR-22-3p

注： A為正常結(jié)腸組織，B為幼年性息肉組織，C為腺瘤性息肉組織。圖1 各組組織中的NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.1 Positive expression of NLRP3 protein in the tissues of each group(immunohistochemical method,×400)

2.2 不同臨床病理特征結(jié)腸息肉組織中NLRP3、miR-22-3p表達(dá)

不同性別、年齡、息肉部位、黏膜狀態(tài)患兒結(jié)腸息肉組織中NLRP3、miR-22-3p表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腺瘤性息肉、息肉多發(fā)、息肉直徑≥2.5 cm的結(jié)腸息肉患兒中NLRP3陽(yáng)性表達(dá)、miR-22-3p低表達(dá)的比例逐漸升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同臨床病理特征結(jié)腸息肉組織中NLRP3、miR-22-3p表達(dá)[n(%)]Tab.3 Expression of NLRP3 and miR-22-3p in CP with different clinicopathological features[n(%)]

2.3 兒童結(jié)腸息肉發(fā)展為腺瘤性的單因素和多因素分析

以兒童結(jié)腸息肉是否發(fā)展為腺瘤性作為因變量，以性別、年齡、息肉部位、息肉數(shù)目、黏膜狀態(tài)、息肉直徑、NLRP3、miR-22-3p為自變量進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，再以單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的息肉數(shù)目、息肉直徑、NLRP3、miR-22-3p為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，NLRP3是影響結(jié)腸息肉發(fā)展為腺瘤性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，miR-22-3p是影響結(jié)腸息肉發(fā)展為腺瘤性的保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4、表5。

表4 兒童結(jié)腸息肉發(fā)展為腺瘤性的單因素分析Tab.4 Univariate analysis of adenomatous CP in children

表5 兒童結(jié)腸息肉發(fā)展為腺瘤性的多因素分析Tab.5 Multivariate analysis of adenomatous CP in children

3 討論

結(jié)腸息肉是兒童腸道常見(jiàn)病，主要由黏膜過(guò)度生長(zhǎng)所致，其發(fā)展過(guò)程中極易惡變[8]。結(jié)腸息肉發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能與環(huán)境、遺傳、基因異常表達(dá)等因素有關(guān)[9-10]。結(jié)腸息肉早期時(shí)息肉直徑較小，臨床癥狀缺乏特異性，極易被忽視，使得部分患者就診時(shí)已發(fā)展為腺瘤，或已出現(xiàn)癌變[11-12]。因此，尋找與結(jié)腸息肉發(fā)展過(guò)程相關(guān)的生物標(biāo)志物，已成為目前的研究熱點(diǎn)。研究表明，結(jié)腸黏膜長(zhǎng)期的炎性刺激是結(jié)腸息肉公認(rèn)的病因之一[13]。NLRP蛋白家族作為炎性小體的關(guān)鍵組成部分，其在纖維化、腫瘤及炎癥等發(fā)生發(fā)展中有重要作用[14-15]。NLRP3受高血糖、游離脂肪酸、低密度脂蛋白等多種激活因素刺激和調(diào)節(jié)，其激活后可誘導(dǎo)多種炎性因子的成熟及分泌，引發(fā)組織損傷及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16]。miR-22-3p是哺乳動(dòng)物中常見(jiàn)的miRNA之一，廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞和組織中，可通過(guò)與靶基因3′非編碼區(qū)特異結(jié)合，導(dǎo)致靶基因沉默、抑制蛋白質(zhì)表達(dá)等，進(jìn)而在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17-18]。Wang等[19]研究結(jié)果顯示，miR-22-3p通過(guò)靶向NLRP3抑制尿酸單鈉誘導(dǎo)的痛風(fēng)性炎癥。Hu等[20]研究中miR-22-3p通過(guò)靶向NLRP3對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮炎性損傷發(fā)揮保護(hù)作用。而本研究結(jié)果同樣顯示結(jié)腸息肉組織中NLRP3與miR-22-3p存在負(fù)相關(guān)，與既往研究文獻(xiàn)以及生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。此外，本研究結(jié)果中NLRP3及miR-22-3p在結(jié)腸息肉組織中分別表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，腺瘤性息肉、息肉多發(fā)、息肉直徑≥2.5 cm的結(jié)腸息肉患兒中NLRP3陽(yáng)性表達(dá)、miR-22-3p低表達(dá)的比例較高，且二者均是結(jié)腸息肉疾病進(jìn)展的影響因素。王洪等[21]研究結(jié)果表明，NLRP3的異常表達(dá)將引發(fā)免疫紊亂，刺激炎性因子的釋放，減弱腸道免疫應(yīng)答，引發(fā)炎癥性腸病。結(jié)合NLRP3與miR-22-3p間的調(diào)控關(guān)系結(jié)果及既往文獻(xiàn)中NLRP3在兒童炎癥性腸病免疫機(jī)制中的作用，推測(cè)兒童正常結(jié)腸組織在炎癥等作用下出現(xiàn)結(jié)腸息肉，miR-22-3p在病理作用下表達(dá)水平降低，miR-22-3p負(fù)調(diào)控NLRP3使其蛋白表達(dá)升高，NLRP3作為免疫應(yīng)答的重要組成部分，其異常高表達(dá)會(huì)進(jìn)一步引發(fā)免疫紊亂，造成腸道微生態(tài)菌群發(fā)生改變，誘導(dǎo)多種炎性因子的成熟和分泌，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使腸道免疫應(yīng)答減弱，而結(jié)腸粘膜在炎癥的反復(fù)刺激下發(fā)生腺瘤性病變。

綜上所述，正常結(jié)腸組織、幼年性息肉組織、腺瘤性息肉組織中NLRP3陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高、miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)，且二者均是結(jié)腸息肉疾病進(jìn)展的影響因素。NLRP3及miR-22-3p有望成為監(jiān)測(cè)結(jié)腸息肉癌變的重要生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)本研究為進(jìn)一步探索新的治療靶標(biāo)提供依據(jù)。然而NLRP3及miR-22-3p參與結(jié)腸息肉疾病進(jìn)展的機(jī)制有待進(jìn)一步探究，樣本量需進(jìn)一步擴(kuò)大。