李曉宇， 于燕妮**， 郭莉莉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，阿爾茨海默病(alzheimer's disease，AD)是癡呆癥的最常見(jiàn)類型，占癡呆病例的60%～70%[1]。AD的臨床表現(xiàn)隨著時(shí)間的推移而惡化：從早期健忘到語(yǔ)言、方向和行為的逐漸遺忘，以及后期嚴(yán)重的記憶力減退和一些身體機(jī)能障礙，直至最終死亡[2]。在AD病理生理改變中，存在明顯的氧化應(yīng)激、線粒體異常和嚴(yán)重的突觸損傷和神經(jīng)元死亡。研究表明，通過(guò)N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor subtype, NMDARs)調(diào)控的興奮性谷氨酸能神經(jīng)傳遞通路對(duì)于神經(jīng)元的突觸可塑性和存活至關(guān)重要[3-4]，但是過(guò)量的NMDARs激活引發(fā)興奮性毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞死亡，與AD發(fā)病的早期密切相關(guān)[5]。燈盞乙素(Scutellarin, Scu)是燈盞花中提取的藥效成分，近年來(lái)的研究表明Scu有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[6]。本課題組對(duì)Scu進(jìn)行深入研究，觀察到Scu能改善AD小鼠的癡呆癥狀[7]，并利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)得到了Scu調(diào)控阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠(APPswe/PS1dE9)腦組織谷氨酸神經(jīng)系統(tǒng)傳遞通路相關(guān)蛋白的重要線索[8]。鑒于谷氨酸神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵突觸元件NMDARs與AD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，本研究推測(cè)Scu可能通過(guò)調(diào)控NMDARs參與對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并采用Aβ1-42寡聚體作用于具有人神經(jīng)元形態(tài)和特征的人源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞，誘導(dǎo)AD神經(jīng)元損傷的細(xì)胞模型，并通過(guò)檢測(cè)NMDARs功能性亞基NMDAR1蛋白及mRNA表達(dá)情況，進(jìn)一步探究Scu在Aβ寡聚體毒性背景下對(duì)NMDAR1的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用Scu(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度98%，批號(hào)為ZL20161012037)，Aβ1-42寡聚體(強(qiáng)耀生物科技有限公司，純度95.27%，貨號(hào)為04010011526)，人源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞生物研究所，編碼為KCB2006107YJ)，NMDAR1抗體(博士德)，ROS、 T-SOD測(cè)定試劑盒(南京建成)，BIO-RAD電泳設(shè)備(美國(guó)Bio-Rad)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher)。

1.2 研究方法

1.2.1藥物處理 粉末狀β1-42寡聚體用預(yù)冷的六氟異丙醇(HFIP)充分溶解并分裝，使終濃度為1 mmol/L，風(fēng)干、-80 ℃保存，使用前加不含酚紅的F12培養(yǎng)基充分溶解，4 ℃冰箱放置24 h后離心取上清使用[9]。 Scu精確稱量分裝后置4 ℃冰箱備用，使用前用高糖DMEM充分稀釋并用0.22微孔注射濾器過(guò)濾。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 SH-SY5Y細(xì)胞置于完全培養(yǎng)液(高糖 ∶血清 ∶抗生素比例為9 ∶1 ∶0.1)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為5% CO2、37 ℃，2 d換液1次，4 d傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]。細(xì)胞分為對(duì)照組、Aβ寡聚體處理組、Scu處理組和Scu+Aβ寡聚體處理組[11]，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)不加任何藥物處理。根據(jù)課題組前期采用細(xì)胞增值及毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8法)篩選確定本研究所用藥物濃度：Scu處理組10 μmol/L Scu 作用48 h，Aβ寡聚體處理組給予1 μmol/L Aβ寡聚體作用24 h，Scu+Aβ寡聚體處理組先予10 μmol/L Scu 預(yù)處理24 h、再加入1 μmol/L Aβ作用24 h[12]。收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3倒置相差顯微鏡觀穿細(xì)胞 將培養(yǎng)的活細(xì)胞放在倒置相差顯微鏡載物臺(tái)上，用40×放大鏡觀察對(duì)比各組細(xì)胞密度、輪廓胞質(zhì)及分裂情況，并進(jìn)行拍照記錄。

1.2.4蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)NMDAR1蛋白表達(dá) 將1.2.2步驟收集的各組細(xì)胞分別清洗3次，取適量總蛋白提取液與細(xì)胞作用，收集總蛋白，測(cè)定濃度；采用SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白，進(jìn)一步電轉(zhuǎn)至甲醇預(yù)處理的聚偏二氟乙烯膜；先后與蛋白一抗(β-actin稀釋比例1 ∶200、NMDAR1稀釋比例1 ∶500)和二抗(二抗稀釋比例1 ∶50 000)作用，顯影系統(tǒng)觀察結(jié)果 。用Bandscan分析灰度值，結(jié)果以目標(biāo)蛋白條帶與β-action條帶的灰度比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NMDAR1 mRNA表達(dá)水平 RNA提?。?收集細(xì)胞，Trizol試劑裂解細(xì)胞，加氯仿分層，收集水相層RNA。RNA沉淀：加異丙醇搖均沉淀RNA。RNA清洗：收集沉淀，用無(wú)RNase的75%乙醇清洗2次；RNA干燥，溶解。RNA濃度測(cè)定：取2 μL溶解后的RNA用微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280，換算OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0滿足實(shí)驗(yàn)要求。RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×40 mg/L，RNA于-80 ℃冰箱保存。逆轉(zhuǎn)錄cDNA(RNA上樣質(zhì)量4.884 μg)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：cDNA做6倍稀釋，反應(yīng)體系為稀釋后cDNA 4 μL，F(xiàn)orward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL，Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，H2O 4.8 μL；引物序列為β-actin(Forward 5′-AGCGAG CATCCCCCAAAGTT-3′，Reverse 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，285 bp)， NMDAR1(Forward 5′-CCGTG AGAGACAACAAGCTG-3′，Reverse 5′-ATACCGAACCCACGTCTTGT-3′，227 bp)；反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

1.2.6熒光探針?lè)y(cè)定各組細(xì)胞氧自由基(ROS)水平 用PBS稀釋DCFH-DA探針，調(diào)整探針濃度為10 μmol/L。收集細(xì)胞，用稀釋好的DCFH-DA重懸細(xì)胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，每隔5 min混勻，使探針與細(xì)胞充分接觸。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)525 nm處熒光值，ROS熒光值與ROS的含量成正比。

1.2.7黃嘌呤氧化酶法測(cè)定各組細(xì)胞超氧化物歧化酶(T-SOD)的活力 收集各組細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞、離心，收集上清液。取96孔板，設(shè)定對(duì)照孔(蒸餾水)和測(cè)定孔(細(xì)胞上清)，依次加入工作液后混勻，37 ℃孵育40 min，各管加入顯色劑2 mL孵育10 min，于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度值并按公式換算T-SOD活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，倒置顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞密度較大，多數(shù)細(xì)胞呈梭形，少數(shù)細(xì)胞呈三角形，細(xì)胞輪廓清晰，樹突分支較多，胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)分裂細(xì)胞；與對(duì)照組比較，Scu處理組細(xì)胞密度、輪廓、胞質(zhì)、分裂細(xì)胞的形態(tài)變化不大，但三角形分化的細(xì)胞增加，突觸縮短變粗；與對(duì)照組比較，Aβ寡聚體處理組梭形細(xì)胞及三角形細(xì)胞明顯減少，部分細(xì)胞突起縮短變細(xì)，樹突分支減少，胞質(zhì)減少，細(xì)胞分裂少見(jiàn)；Scu+Aβ寡聚體處理組細(xì)胞密度及分支較Aβ寡聚體處理組增加，胞質(zhì)較Aβ寡聚體處理組豐富。

注：A為對(duì)照組，B為Scu處理組，C為Aβ寡聚體處理組，D為Scu+Aβ寡聚體處理組。圖1 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h的形態(tài)學(xué)觀察(倒置顯微鏡，×40)Fig.1 Cells of each group after 48 h of cell culture (inverted microscope,×40)

2.2 NMDAR1蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，Scu處理組細(xì)胞NMDAR1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細(xì)胞NMDAR1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細(xì)胞中NMDAR1蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表1。

注：1-4分別為對(duì)照組，Aβ寡聚體處理組， Scu處理組，Scu+Aβ處理組。圖2 NMDAR1蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression volume of NMDAR1 protein

2.3 NMDAR1 mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較，Scu處理組細(xì)胞NMDAR1 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細(xì)胞NMDAR1 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細(xì)胞NMDAR1 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞NMDAR1蛋白及mRNA表達(dá)Tab.1 NMDAR1 protein and mRNA expression

2.4 ROS含量

與對(duì)照組比較，Scu處理組細(xì)胞ROS含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細(xì)胞ROS含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細(xì)胞ROS含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5 T-SOD含量

與對(duì)照組比較，Scu處理組細(xì)胞T-SOD含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細(xì)胞T-SOD含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細(xì)胞T-SOD含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞ROS和T-SOD的含量Tab.2 ROS and T-SOD content of cells

3 討論

AD的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中基因突變學(xué)說(shuō)、Aβ毒性學(xué)說(shuō)、Tau蛋白異常修飾學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、線粒體障礙學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)等已成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)[13]，但很少有研究關(guān)注AD的電生理特性，尤其是突觸可塑性。突觸可塑性是參與學(xué)習(xí)和記憶的重要機(jī)制，學(xué)習(xí)和記憶是高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要組成部分[14]，研究表明NMDARs通過(guò)參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和長(zhǎng)時(shí)程減弱的形成調(diào)控突觸的可塑性和神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)[15]。NMDARs是谷氨酸興奮信號(hào)傳遞的關(guān)鍵蛋白之一，具有3種主要亞基：NMDAR1(NR1)，NMDAR2(NR2A-D)和NMDAR3(NR3)[16]。功能性NMDARs是由至少一個(gè)NR1亞基與兩個(gè)或多個(gè)NR2A-D亞基組成的四聚體，有時(shí)還包括NR3亞基，NMDAR1在整個(gè)大腦和整個(gè)發(fā)育的各個(gè)階段均表達(dá)[17]。盡管NMDARs活性是大腦生理功能所必須，但過(guò)量的NMDARs介導(dǎo)Ca2+超載并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞死亡是AD發(fā)生神經(jīng)退行性變的病理基礎(chǔ)[18]。

谷氨酸是大腦主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸傳遞正常的情況下，NMDARs的離子通道被Mg2+阻滯，并且僅在短時(shí)間內(nèi)被谷氨酸激活，介導(dǎo)Ca2+適量進(jìn)入細(xì)胞，參與突觸可塑性和細(xì)胞存活。在病理?xiàng)l件下，比如突觸間隙谷氨酸濃度病理性升高、NMDARs表達(dá)增加以及能改變靜息膜電位的其他干擾均可能會(huì)引起NMDARs的過(guò)度激活，NMDARs的過(guò)度激活介導(dǎo)大量Ca2+流入神經(jīng)元，從而觸發(fā)各種可能導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡的過(guò)程[19]，包括介導(dǎo)線粒體的Ca2+超載和半胱氨酸蛋白酶及一氧化氮合酶(nNOS)等Ca2+依賴性酶激活，導(dǎo)致一氧化氮(NO)產(chǎn)量增加[20]。線粒體Ca2+超載會(huì)破壞膜的電化學(xué)梯度，從而使ATP合成失效，呼吸鏈故障，導(dǎo)致抗氧化與氧化失衡，T-SOD減少，ROS增加，例如NO與超氧陰離子(O2·-)反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO)，后者又可以氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA[21-22]。上述過(guò)程是NMDARs介導(dǎo)的興奮性毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，NMDARs是興奮性毒性過(guò)程中重要的Ca2+通道，NMDARs 介導(dǎo)Ca2+超載損傷細(xì)胞是AD發(fā)病的重要機(jī)制之一[23-24]。

其他學(xué)者和本課題組前期研究均觀察到Aβ寡聚體與神經(jīng)元作用后增加Ca2+流入神經(jīng)元介導(dǎo)細(xì)胞損傷[25-26]，相同實(shí)驗(yàn)條件下，本研究采用Aβ寡聚體與SH-SY5Y細(xì)胞孵育后，觀察到NMDAR1 mRNA及蛋白表達(dá)均增加，推測(cè)Aβ寡聚體可能調(diào)控了NMDAR1蛋白的轉(zhuǎn)錄程序，介導(dǎo)NMDAR1蛋白表達(dá)增加，Aβ寡聚體處理組還觀察到細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS增加和T-SOD降低，倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞減少和突觸縮短變細(xì)，提示Aβ寡聚體可能參與調(diào)控功能性亞基NMDAR1的表達(dá)介導(dǎo)Ca2+超載損傷神經(jīng)細(xì)胞。美金剛是目前世界公認(rèn)的可用于中重度AD患者改善記憶和認(rèn)知缺陷的藥物[27-28]，其治療作用的關(guān)鍵在于可與NMDARs的非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，研究表明美金剛與NMDARs通道為低親和力結(jié)合，抑制NMDARs通道的同時(shí)逐步解離失效以保留了部分NMDARs的生理功能，從而增強(qiáng)了美金剛的耐受性并且降低不良事件發(fā)生[29]。本研究用Scu預(yù)處理后，下調(diào)了Aβ寡聚體處理組NMDAR1蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，缺乏NMDAR1亞基的NMDARs不能正常介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，但本研究結(jié)果提示Scu并不是完全中斷NMDAR1表達(dá)，仍然保留NMDAR1的活性，有類似于“美金剛”改善神經(jīng)元損傷的作用，Scu+Aβ寡聚體處理組還觀察到ROS減低和T-SOD增加，提示細(xì)胞的氧化應(yīng)激得到改善，其次該組細(xì)胞密度及樹突分支較Aβ寡聚體處理組增加，佐證了本研究上述推測(cè)。所以本研究認(rèn)為Scu可能參與下調(diào)功能性亞基NMDAR1蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而對(duì)抗Aβ寡聚體的毒性作用。