郭冬芬， 任真奎， 安小瓊， 陳明， 孫嫚彬，吳昌學*， 禹文峰*

(1.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州省第二人民醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫(yī)科大學 兒科系， 貴州 貴陽 550004)

腦卒中是造成成人殘疾與死亡的主要疾病之一，目前臨床仍然沒有良好的預防與治療方案[1-2]，也沒有比較明確的早期輔助檢測的診斷指標。轉錄測序是對生物基因在轉錄水平表達進行的大規(guī)模檢測，可揭示生物在轉錄水平發(fā)生的差異表達。生物信息學作為一門新生學科，因為其擁有的強大數據支撐及復雜算法，近年來被廣泛運用于臨床醫(yī)學及基礎醫(yī)學的數據分析中[3]。對轉錄測序結果進行生物信息學分析，能在一定置信度下縮小分析范圍，更精準地找到研究目標。近年來，利用轉錄測序結合生物信息學分析，試圖尋找診斷、預后和治療腦卒中標志物，已然成為研究熱點[4-6]。有研究對腦缺血再灌注小鼠腦組織進行轉錄測序，并通過生物信息學分析預測，發(fā)現巨噬細胞在腦缺血再灌注后的神經血管重塑中發(fā)揮重要作用[7]；而對腦缺血再灌注小鼠骨骼肌進行轉錄測序，結果顯示腦缺血性卒中小鼠模型中與蛋白水解和神經肌肉連接相關基因表達發(fā)生顯著變化[8]；提示即使同樣是腦缺血再灌注小鼠模型，但因研究的側重點不同，也可能會得到不同的研究發(fā)現。因此本次實驗選取小鼠小膠質細胞BV2進行氧糖剝奪再灌注處理，并結合生物信息學分析，希望找出因氧糖剝奪再灌注誘導的差異表達較大的基因，以期篩選出新的分子靶點，為腦卒中的研究提供新的研究思路及方向。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、主要試劑與儀器

小鼠小膠質細胞BV2購于中科院上海細胞庫。引物序列購于上海生工，cDNA逆轉試劑盒購于Takara公司，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)相關試劑購于Genstar，dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)完全培養(yǎng)基、無糖培養(yǎng)基及胎牛血清購于Gibico，實時熒光定量檢測儀器(Biorad)，-80 ℃冰箱(中國HAIER)，核酸定量儀(Thermo Fish Scientific)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 BV2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃，為正常組(control組)。待細胞密度生長至70%～80%，根據實驗需要選擇繼續(xù)傳代培養(yǎng)或用于實驗種板；將生長狀況良好的BV2細胞用胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀用培養(yǎng)基重懸并進行細胞計數；細胞懸液按(5～6)×107個/ L接種于6孔板中，待其密度生長至50%～60%時，將培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基，置于5% CO2、94%N2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，隨后用磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌3次，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即為氧糖剝奪再灌注組(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R組)。

1.2.2差異基因篩選及功能、通路富集分析 對轉錄數據進行分析處理，限定條件為log2(fold change)≤-5、或log2(fold change)≤5，P≤0.01，篩選出差異表達基因。在線網站(https://www.xiantao.love/products)對差異表達基因進行基因本體論(gene ontology, GO；包括細胞組成成分、分子功能以及生物功能分析)以及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。

1.2.3蛋白質互作網絡分析 為了進一步了解差異表達基因的分子間相互作用，在線網站String(https://cn.string-db.org/)對差異表達基因進行蛋白質互作網絡分析，cytoHubba插件對蛋白互作分析結果進一步處理，篩選出在OGD/R組中評分較高的10個關鍵基因。

1.2.410個關鍵基因的mRNA表達檢測 qRT- PCR檢測經cytoHubba插件篩選出的10個基因的mRNA表達水平。用TRIZOL分別提取control組、OGD/R組的總RNA并測定核酸濃度，取0.5～1 μg RNA按試劑盒說明書進行cDNA的合成。得到的cDNA凍存于-80 ℃冰箱或用于后續(xù)的實時熒光定量實驗。進行qRT- PCR時，按照試劑盒操作方案進行模板、上下游引物、SYBR混合體系的配制，然后按照以下條件上機循環(huán)擴增：95 ℃ 2 min，95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個循環(huán)；95 ℃ 5 s完成反應。引物序列見表1，以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法計算該10個關鍵基因的相對表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結果

2.1 OGD/R誘導基因差異表達

control組和OGD/R組的轉錄組測序結果顯示，共檢測出22 621個基因，見圖1A。相較于control組，OGD/R組篩選出122個基因發(fā)生差異表達(P<0.01)，其中有108個基因表達上調，有14個基因表達下調，見圖1B。

注：A為轉錄測序結果分析熱圖，B為差異基因火山圖。圖1 差異表達基因篩選Fig.1 Screening of differential expressed genes

2.2 差異表達基因的功能富集分析

GO分析結果顯示122個差異表達基因主要與受體配體激活、靜脈曲張、正調控STAT信號通路具有重要相關性(圖2A)。KEGG分析結果顯示，差異表達基因主要富集到白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)信號通路中(圖2A)。在線網站String對122個差異表達基因進行蛋白質網絡互作分析(圖2B)，cytoscope插件對差異表達基因進行分析計算 ，篩選出其中10個評分較高的關鍵基因(圖2C)，包括IL-6、粒細胞集落刺激因子(colony stimulating factor 3,Csf3)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(colony stimulating factor 2,Csf2)、Cd40 抗原(Cd40 antigen,Cd40)、IL-1β、前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)、絲氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制劑B分支成員2(serine/cysteine peptidase inhibitor, clade B, member 2,Serpinb2)、IL-10、CXC基序趨化因子配體2 [chemokine (C-X-C motif) ligand2,Cxcl2]以及IL-12b。

注：A為GO和KEGG分析結果，B為蛋白質互作網絡分析結果，C為cytoHubba(插件)篩選結果。圖2 差異表達基因的功能富集分析Fig.2 Gene function enrichment analysis

2.3 qRT-PCR驗證差異表達的基因

qRT-PCR結果顯示，與control組比較，OGD/R組IL-6、IL-1β、Csf2以及Serpinb2 mRNA表達增加(圖3A)，IL-10、IL-12b、Cd40、Csf3、Cxcl2以及Ptgs2 mRNA表達降低(圖3B)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

腦卒中主要分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占所有腦卒中類型的80%[9- 10]，且具有高致殘、高致死、高復發(fā)的特點[11]，目前臨床用于治療腦卒中的主要方法是靜

注：A為OGD/R組表達上調的基因，B為OGD/R組表達下調的基因；與control組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 10個關鍵基因的mRNA表達水平Fig.3 mRNA expression level of 10 key genes

脈溶栓[12-13]和血栓取出術[14-15]，但這些治療方案仍面臨著多方面的問題。因而，繼續(xù)探索腦卒中的發(fā)病機制，尋找新的分子靶點對于治療腦卒中仍然具有重要意義。轉錄測序結合生物信息學分析能在具有一定可信度的條件下找到新的分子靶點，近年來在基礎醫(yī)學及臨床醫(yī)學被廣泛運用[16-19]，通過對腦梗組和正常組進行轉錄測序并對其進行分析、驗證，試圖尋找腦卒中相關分子靶點[20-21]。

因此，本研究通過對control組及OGD/R組細胞進行轉錄組測序，對轉錄數據進行分析，發(fā)現相較于control，OGD/R組中存在大量差異表達的基因，其中表達差異大于五倍且具有統(tǒng)計學意義的基因有122個。針對這122個基因，進行了更近一步的GO、KEGG以及蛋白質網絡互作分析，最后篩選出122個差異表達基因中10個評分較高的基因。并且qRT-PCR結果顯示，促炎因子IL-6和IL-1βmRNA表達上調，抗炎因子IL-10 mRNA表達下調，表明OGD/R模型的建立成功[22-23]。Csf是一種集落刺激因子，其中Csf2為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，參與調控細胞的生存和增殖，在炎癥部位，它能通過募集髓樣細胞并增強其存活和活化而發(fā)揮促炎作用[24]。OGD/R處理后Csf2表達增加，參與OGD/R誘導的炎癥反應的放大，而Csf3表達發(fā)生下調。除此之外，qRT-PCR結果還顯示，Serpinb2 mRNA表達在OGD/R組發(fā)生明顯增加。有研究發(fā)現，在受到炎癥刺激時Serpinb2表達會明顯增加[25]。但是，同時Cd40、Ptgs2、Cxcl2、IL-12bmRNA表達發(fā)生下調。猜測這可能是由于細胞存在的自我調節(jié)作用，由于其他炎性指標增加，細胞為了避免炎癥反應的過度放大，保持動態(tài)平衡，從而促進以上幾個炎性因子的表達下調，但這其中的機制還需要更進一步的探索表明。

綜上所述，本研究發(fā)現OGD/R處理會誘導大量基因差異表達，通過對轉錄測序結果進行分析可篩選出關鍵基因，進一步的qRT-PCR驗證發(fā)現關鍵基因發(fā)生差異表達，這對于進一步探索腦卒中發(fā)病機制研究具有指示意義。