張帥， 朱曉青， 王艷麗， 程枝梅， 李勇軍， 陸苑

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 介入科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004; 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

吡非尼酮(5-methyl-1-phenyl-2-[1H]-pyridone, pirfenidone, PFD)是一種新型小分子抗炎及抗纖維化藥物，可減少膠原分泌，從而抑制纖維化進(jìn)程，且已被美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局批準(zhǔn)用于肺纖維化患者的臨床治療[1]。由于PFD的廣泛抗纖維化及抗炎作用，亦有將其應(yīng)用于腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，開展了一系列PFD協(xié)助增強(qiáng)抗癌效果的研究。體內(nèi)研究表明，PFD可通過調(diào)節(jié)胰腺星形細(xì)胞活性、協(xié)同吉西他濱發(fā)揮抗胰腺癌作用，抑制胰腺癌生長[4]；與單純放射治療和舒尼替尼聯(lián)合放射治療相比，PFD聯(lián)合舒尼替尼及放射治療可以明顯抑制非小細(xì)胞肺腫瘤的增長[5]；PFD可通過抑制癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞活性，聯(lián)合順鉑可協(xié)同殺死非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，并延緩非小細(xì)胞肺癌動物模型體內(nèi)腫瘤的進(jìn)展[6]。課題組前期研究曾發(fā)現(xiàn)PFD可抑制大鼠活化肝星狀細(xì)胞的增殖，并能降低膠原伴侶分子-熱休克蛋白47及膠原I的表達(dá)[7]；PFD可通過Wnt/β-Catenin信號通路抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖并促進(jìn)其凋亡[8]，以上結(jié)果提示PFD是治療肝癌的潛在藥物，但這一作用未在肝癌模型動物體內(nèi)驗(yàn)證?；谖墨I(xiàn)報(bào)道的PFD與化療藥物聯(lián)用具有協(xié)同增效作用，以及課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PFD具有抗肝腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠肝癌細(xì)胞(H22)移植瘤模型，觀察PFD聯(lián)合阿霉素(doxorubicin，DOX)對小鼠H22肝癌移植瘤的協(xié)同抗腫瘤作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為PFD用于治療肝癌的合理性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司動物[許可證號SCXK(遼)2020-0001]，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周：自由飲水，晝夜交替光照，溫度維持在18～25 ℃，相對濕度為50%～70%，所有動物養(yǎng)護(hù)和實(shí)驗(yàn)研究均嚴(yán)格遵守國家衛(wèi)生研究院動物養(yǎng)護(hù)和使用指南，實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(1800821)。

1.1.2細(xì)胞及試劑 小鼠H22肝癌細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司， 吡啡尼酮(上海源葉生物科技有限公司)，鹽酸多柔比星(大連美侖生物科技有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素(美國Gibco公司)，臺盼藍(lán)染色液(北京索萊寶科技有限公司)，阿奇霉素(大連美侖生物科技有限公司)，阿霉素醇(美國GlpBio公司)，質(zhì)譜級乙腈(德國默克試劑公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜串聯(lián)儀(美國沃特世)，XYN-15LP氮吹儀氮?dú)獍l(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)，ALLEGRA X-30R離心機(jī)(美國Beckman Coulter)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo)，TS100 倒置顯微鏡(日本Nikon)。

1.2 研究方法

1.2.1H22細(xì)胞培養(yǎng) H22細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，細(xì)胞懸浮生長，每2～3 d傳代1次。將細(xì)胞收集至離心管中離心(1 200 r/min，5 min)、吸去上清液，細(xì)胞沉淀用適量培養(yǎng)基重懸，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色，要求細(xì)胞存活率大于95%時可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。H22細(xì)胞再用PBS定容為1×107個/mL，細(xì)胞懸液裝于滅菌EP管中。

1.2.2動物造模 小鼠右腋皮下注射 H22細(xì)胞懸液0.2 mL(細(xì)胞數(shù)1×107個/mL，每次注射前吸取時輕輕搖勻，以保證腫瘤的均勻性)，接種后第7天注射局部長出米粒大小的包塊即表示造模成功。

1.2.3動物分組及給藥 將40只雄性 H22荷瘤小鼠隨機(jī)分為對照組、PFD+末次DOX組、DOX組和PFD+多次DOX組，每組10只。對照組每天腹腔注射生理鹽水0.25 mL，PFD+末次DOX組每天灌胃PFD 200 mg/kg、第15天腹腔注射DOX 2.5 mg/kg，DOX組隔日腹腔注射DOX 2.5 mg/kg，PFD+多次DOX組每天灌胃PFD 200 mg/kg、隔日PFD灌胃后1 h腹腔注射DOX 2.5 mg/kg。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1小鼠的一般狀況、移植瘤體積、質(zhì)量、抑瘤率 給藥周期內(nèi)隔天稱量體質(zhì)量，并觀察小鼠的一般狀況；用游標(biāo)卡尺測量小鼠瘤體的長徑(a)、短徑(b)，計(jì)算瘤體體積(V)：V=(a×b2)×0.5，并繪制移植瘤的生長曲線；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時完整剝離腫瘤組織，去除血污和脂肪等組織，稱取瘤體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率(%)=(對照組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。使用Jin公式[9]來評估藥物聯(lián)合用藥的效果(Q)：Q=E(A+B)/EA+(1-EA)EB，EA、EB和E(A+B)表示A、B及其組合的抑制率，組合效果可以分為拮抗(Q<0.85)、加性(0.85<～<1.15)或協(xié)同(Q>1.15)。

1.3.2腫瘤組織病理觀察 取各實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下移植腫瘤組織、福爾馬林固定、石蠟包埋、脫水、切片及HE染色，在顯微鏡(200×)下觀察觀察腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞凋亡。

1.3.3小鼠脾臟指數(shù)測定 各組小鼠脾臟稱重后計(jì)算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾重(mg)/體重(g)。

1.3.4UPLC-MS/MS法測定小鼠血清、腫瘤、心、肝、腎組織中的DOX和DOXol濃度 各組小鼠在第15 天給藥后2 h眼球取血，全血室溫下靜置20 min，3 000 r/min離心20 min，收集血清；脫頸處死小鼠，收集腫瘤、心、肝、脾、肺、腎等組織，清洗殘血后按重量比1 ∶2加入生理鹽水勻漿；取100 μL組織勻漿液，加入IS (0.1 ng/L)20 μL，渦混后加入5%甲酸甲醇500 μL，-20 ℃冷凍30 min，超聲5 min，離心(14 000 r/min，10 min)，氮?dú)獯蹈缮锨逡海?0%甲醇500 μL復(fù)溶(渦混1 min、超聲5 min)，離心(14 000 r/min，10 min)；按照課題組前期建立的方法UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析[10-12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H22移植瘤小鼠一般狀態(tài)、移植瘤體積、質(zhì)量和抑瘤率

移植腫瘤細(xì)胞后一周，右腋皮下有米粒大小包塊，移植瘤成功率為100%。實(shí)驗(yàn)期間，DOX組、對照組小鼠精神狀態(tài)隨著給藥時間的增加，狀態(tài)變差，毛發(fā)粗糙，進(jìn)食與飲水量明顯減少，眼球突出；PFD+末次DOX組以及PFD+多次DOX組小鼠的該類情況較輕；各組H22移植瘤小鼠體質(zhì)量變化如圖1所示，與對照組比較，PFD+末次DOX組小鼠體質(zhì)量未見明顯變化，DOX組小鼠體質(zhì)量增加緩慢，PFD+多次DOX組小鼠體質(zhì)量增加較DOX組快。各組H22移植瘤小鼠腫瘤生長曲線見圖2，與對照組比較，3個治療組均能抑制腫瘤生長(P<0.05)，PFD與DOX聯(lián)合對腫瘤的體積增長抑制作用優(yōu)于PFD或DOX單獨(dú)用藥組(P<0.05)。如表1和圖3所示，PFD+末次DOX組、DOX組和PFD+多次DOX組的抑瘤率分別為19.04%、32.48%和66.86%，PFD+多次DOX組的抑瘤率明顯高于DOX組和PFD+末次DOX組(P<0.001)。PFD與DOX相互作用指數(shù)Q為1.47，提示PFD與DOX聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。

圖1 各組H22移植瘤小鼠體質(zhì)量變化 Fig.1 Changes of body weights in H22 HCC xenograft mice of each group

圖2 各組H22移植瘤小鼠腫瘤體積 Fig.2 Tumor volumes of H22 HCC xenograft mice in each group

2.2 小鼠H22移植瘤組織病理觀察

HE染色后在顯微鏡觀察(圖4)，對照組的腫瘤細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞排列緊密；DOX組腫瘤細(xì)胞排列疏松，并且呈現(xiàn)不規(guī)則形，有大面積的空隙、壞死或消融現(xiàn)象；PFD+末次DOX組腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)可見變性現(xiàn)象；PFD+多次DOX組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大面積空隙，片狀壞死或消融現(xiàn)象比DOX組更加明顯，提示PFD與DOX聯(lián)用能增強(qiáng)DOX對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

注：與對照組比較，(1)P<0.001，(2)P<0.05； (3)與DOX組比較，P<0.001。圖3 各組H22移植瘤小鼠腫瘤質(zhì)量Fig.3 Tumor weights of H22 HCC xenograft mice in each group

表1 各組H22移植瘤小鼠的抑瘤率Tab.1 Tumor inhibition rates of the H22 HCC-bearing

2.3 H22移植瘤小鼠脾臟指數(shù)

脾臟指數(shù)可反映免疫器官的發(fā)育程度和免疫細(xì)胞的功能[7]。如圖5所示，與對照組比較，DOX組小鼠脾臟指數(shù)明顯下降(P<0.01)，這可能與DOX的免疫抑制有關(guān)；PFD+末次DOX組小鼠脾臟指數(shù)大于對照組，但差異無；PFD+多次DOX組與DOX組比較，脾臟指數(shù)明顯上升(P<0.01)，提示PFD可能有改善DOX導(dǎo)致的免疫抑制作用。

2.4 H22移植瘤小鼠血清、腫瘤、心、肝、腎組織中的DOX和DOXol濃度

如圖6和圖7所示，DOX組和PFD+末次DOX組比較，DOX及其代謝物DOXol在移植瘤小鼠的血清和各組織中累積含量明顯升高(P<0.01)；與DOX組比較，PFD+多次DOX組移植瘤小鼠的血清、腫瘤、腎中DOX濃度升高(P<0.05)，腫瘤、腎中DOXol濃度升高(P<0.05)，肺和心中DOXol濃度降低(P<0.05)，DOXol在血清中濃度過低，未能定量計(jì)算。

圖4 各組H22移植瘤小鼠H22實(shí)體瘤細(xì)胞形態(tài)(HE，×200)Fig.4 Cellular morphology of H22 HCC-bearing mice in each group(HE，×200)

注：(1) 與對照組比較，P<0.001；(2) 與DOX組比較，P<0.01。圖5 各組H22移植瘤小鼠脾臟指數(shù) Fig.5 Spleen indexes of H22 HCC-bearing mice in each group

注：(1)與DOX組比較，P<0.01；(2)與多次DOX組比較，P<0.01。圖6 各組H22移植瘤小鼠血清中DOX濃度Fig.6 Serum DOX concentrations of H22 HCC-bearing mice in each group

3 討論

DOX是一種廣譜抗腫瘤藥物，可抑制腫瘤細(xì)胞RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，屬周期非特異性藥物，常用于肝癌治療中[13-14]。同時，作為一種經(jīng)典的抗腫瘤藥物，DOX在體內(nèi)的代謝過程已比較明確[15-17]。DOX可以經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SLC22A16 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)羰基還原酶1(CBR1) C-13羥基化形成DOXol[17-18]。DOX原形及其代謝物DOXol可通過P-gp (ABCB1, MDR1) 和 ABCC1 (MRP1)轉(zhuǎn)運(yùn)，從細(xì)胞內(nèi)排出[19-20]。相關(guān)研究表明，DOX的代謝產(chǎn)物DOXol在抗腫瘤的同時有較大毒副作用，會導(dǎo)致心臟、骨髓抑制、腎毒性[21-23]。本實(shí)驗(yàn)觀察到DOX具有明顯的抑制腫瘤作用，但同時會導(dǎo)致H22荷瘤小鼠體質(zhì)量減輕、脾腺縮小。DOX聯(lián)合PFD使用后，體質(zhì)量減輕程度和脾腺縮小情況均有所改善，這可能與PFD減輕了DOX的毒性作用有關(guān)。腫瘤組織病理觀察結(jié)果提示PFD與DOX聯(lián)用能增強(qiáng)DOX對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

一般情況下，藥物的藥理學(xué)效應(yīng)與藥物的濃度成正比[24]，即靶部位的藥物濃度越高，藥物的藥理學(xué)效應(yīng)越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)兩藥聯(lián)用后組織分布結(jié)果為：與DOX組比，PFD+DOX組小鼠的血清、移植瘤、腎中DOX濃度顯著升高，特別是移植瘤、腎中的DOXol濃度顯著升高，可能與PFD和DOX聯(lián)合發(fā)揮增效作用有關(guān)。但腎中DOX和DOXol同時增高，會帶來潛在的腎毒性[25]，說明兩藥如果在臨床上長期聯(lián)合使用，需要注意對腎產(chǎn)生的毒副作用。PFD+DOX組小鼠的肺和心中DOXol濃度顯著降低，提示PFD可能有降低DOX的心臟毒性作用。PFD與DOX聯(lián)用改變DOX和DOXol體內(nèi)分布情況，可能與PFD影響了DOX的主要代謝酶(CBR1)或轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC22A16、P-gp、ABCC1)有關(guān)。

注：(1)與PFD+末次DOX組比較，P<0.001；(2)與DOX組比較，P<0.05。圖7 各組H22移植瘤小鼠腫瘤、心、肝、肺和腎中DOX和DOXol濃度Fig.7 The concentrations of DOX and DOXol in the tumors, livers, hearts, lungs, and kidneys of H22 HCC-bearing mice in each group

綜上所述，PFD與DOX聯(lián)用具有增強(qiáng)抗腫瘤作用，PFD可能通過增加腫瘤組織中DOX和DOXol濃度發(fā)揮與DOX協(xié)同抗腫瘤作用，為PFD用于治療肝癌的合理性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床上提高肝癌治療效果及延長肝癌患者生存期提供參考依據(jù)。