王慧玲，閆愛玲，孫磊，張國軍，王曉玥，任建成，徐海英*

鮮食葡萄果實(shí)單萜合成關(guān)鍵基因的eQTL分析

王慧玲1，閆愛玲2，孫磊3，張國軍1，王曉玥1，任建成1，徐海英1*

1北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京 100093；2北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097

【目的】通過對鮮食葡萄果實(shí)單萜合成關(guān)鍵基因進(jìn)行eQTL定位及候選基因挖掘，深入了解單萜合成調(diào)控機(jī)制，為優(yōu)良玫瑰香味葡萄新品種培育及種質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳浴柖嗤摺痢鸲枷阌瘛疐1代群體及親本為供試材料，分別在轉(zhuǎn)色期和成熟期采集葡萄果實(shí)樣品；利用實(shí)時熒光定量qPCR技術(shù)對7個單萜合成途徑基因（、、、、、和）的表達(dá)量進(jìn)行檢測獲得表達(dá)性狀表型數(shù)據(jù)；基于區(qū)間作圖法，采用MapQTL6.0軟件，對單萜基因表達(dá)性狀進(jìn)行eQTL定位分析；將eQTL連鎖標(biāo)記定位到基因組區(qū)域，通過Ensembl Plants和NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋；利用葡萄全基因組芯片技術(shù)檢測不同發(fā)育時期親本果實(shí)樣品中候選基因的表達(dá)譜?！窘Y(jié)果】7個單萜合成基因表達(dá)量在F1代群體中呈現(xiàn)連續(xù)分布數(shù)量遺傳特征；各個單萜基因表達(dá)之間具有顯著的相關(guān)性；在轉(zhuǎn)色期，7個表達(dá)性狀一共定位到13個eQTL，主要位于1號、6號、14號、16號、17號、10號和12號等染色體上，表型解釋率介于12.2%—23.5%。其中位于14號染色體的eQTL（qDXS1-v14、qHDR-v14-1和qTerp-v14）覆蓋相同的遺傳區(qū)間57.582—76.979 cM，qLiner-v10、qTerp-v10和qGermD-v10共定位到10號染色體相同的遺傳區(qū)間；在成熟期，共檢測到16個eQTL，主要位于1號、6號、12號、8號、13號和19號等染色體。qDXS1-m6-2、qDXR-m6-2、qLiner-m6和qGermD-m6共定位到6號染色體139.212—143.161 cM遺傳區(qū)間；針對成熟期與轉(zhuǎn)色期各個基因的表達(dá)量比值變化進(jìn)行定位分析，共檢測到18個eQTL，分別位于1號、3號、7號、10號、12號、15號和19號等染色體。定位于12號染色體的qDXS1-r12-1、qDXR-r12-1、qHDR-r12、qLiner-r12和qGermD-r12覆蓋相同的遺傳區(qū)間6.330—6.967 cM。對多個基因表達(dá)性狀共定位的eQTL區(qū)域進(jìn)行基因注釋，共篩選到90個轉(zhuǎn)錄因子基因，表達(dá)譜及相關(guān)性分析最終確定11候選基因。其中4個候選基因（、、和）與激素信號通路調(diào)控相關(guān)，一個候選基因（）編碼光敏色素作用因子與光響應(yīng)相關(guān)，還有一些編碼Myb類、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子或者未知功能蛋白基因?！窘Y(jié)論】在兩個不同的生長發(fā)育期共檢測到37個與單萜合成基因表達(dá)性狀連鎖的eQTL，主要定位于6號、10號、12號和14號染色體。基于基因注釋和表達(dá)譜分析結(jié)果，確定了包含和在內(nèi)的11個可能的候選基因，這些候選基因與多個單萜基因表達(dá)高度相關(guān)。

葡萄；單萜；關(guān)鍵基因；eQTL

0 引言

【研究意義】單萜是葡萄果實(shí)重要的次生代謝產(chǎn)物，賦予葡萄及葡萄酒怡人的玫瑰香味。深入研究其合成調(diào)控機(jī)制，挖掘調(diào)控單萜合成的關(guān)鍵基因，對于指導(dǎo)香味葡萄分子育種及提高品質(zhì)育種的效率具有重要的理論意義和應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】單萜是葡萄果實(shí)中含量最豐富的萜類化合物，根據(jù)游離態(tài)單萜類化合物的含量高低，歐洲種釀酒葡萄品種被分為玫瑰香型（游離態(tài)單萜化合物總量高達(dá)6 mg?L-1）、非玫瑰香芳香型（游離態(tài)單萜化合物總量達(dá)1-4 mg?L-1）和非芳香型（游離態(tài)單萜化合物總量低于1 mg?L-1）三類[1]。通過比較基因組學(xué)和反向遺傳學(xué)等方法，人們對于單萜物質(zhì)合成的途徑和一些關(guān)鍵的基因有了一定了解。葡萄中的單萜主要是通過位于質(zhì)體中的脫氧-木酮糖-5-磷酸/甲基磷酸赤蘚糖途徑（DXP/MEP）合成[2]。由丙酮酸（pyruvate）和3-磷酸甘油醛（G3P）開始，在1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS1和DXS3）的作用下轉(zhuǎn)化成1-脫氧-木酮糖-5-磷酸（DOXP），之后1-脫氧-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）催化將DXP轉(zhuǎn)化成2-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）。MEP經(jīng)一系列酶作用形成1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯-4-二磷酸（HMBPP），并在異戊烯基單磷酸激酶（HDR）的作用下催化形成中間體異戊烯基焦磷酸（IPP，C5）及其雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP，C5），最后各1分子的兩同分異構(gòu)中間體IPP和DMAPP在香葉基二磷酸合酶（GPPS）的作用下經(jīng)頭尾縮合生成香葉基二磷酸（GPP）。GPP是所有單萜化合物生物合成的底物，在單萜合成酶（mono-TPS）作用下催化合成一系列單萜化合物。但是對調(diào)控單萜合成的關(guān)鍵基因位點(diǎn)還不明確，是由合成途徑中的某個基因還是多個基因調(diào)控，亦或是存在其他的調(diào)節(jié)因子。基于遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀基因座（quantitative trait loci，QTL）的掃描與定位方法，國外科學(xué)家依據(jù)人類對葡萄果實(shí)香味的感官評價進(jìn)行QTL分析，將相關(guān)基因定位在1、5和7號染色體上[3-4]。此后，對3—5種單萜化合物進(jìn)行氣相質(zhì)譜（GC/MS）測量分析作為性狀分離數(shù)據(jù)，在第5、10連鎖群上檢測到與五種單萜含量有關(guān)的QTL位點(diǎn)，其中在第5號連鎖群上發(fā)現(xiàn)一個控制5種單萜總含量的主效QTL與單萜合成途徑的第一個基因定位在一起[5-6]，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)葡萄果實(shí)中單萜含量高低與的第1 822位單核苷酸突變密切相關(guān)[7]。近年來，國內(nèi)科學(xué)家也針對本土葡萄品種進(jìn)行單萜的遺傳位點(diǎn)分析，鑒定出一些新的QTL位點(diǎn)[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前的研究主要集中于感官評價和單萜化合物分析數(shù)據(jù)，忽略了基因表達(dá)水平的差異對性狀的影響。生物的表型性狀受基因控制，而基因的表達(dá)水平則是基因和表型性狀間的橋梁，因此，鑒定出調(diào)控基因表達(dá)水平的調(diào)控因子，可以更加深入地揭示生物代謝發(fā)育的遺傳機(jī)理。將基因表達(dá)水平視為數(shù)量性狀，并按照遺傳學(xué)方法對這些數(shù)量性狀進(jìn)行QTL定位，得到基因表達(dá)的數(shù)量性狀基因座（expression quantitative trait loci，eQTL），可以鑒別控制基因表達(dá)的上游調(diào)控位點(diǎn)、推斷出調(diào)節(jié)基因和被調(diào)節(jié)基因之間的相關(guān)關(guān)系及因果關(guān)系，以闡明基因調(diào)控的機(jī)制，從而在表達(dá)及調(diào)控兩個水平研究控制復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)[11]。eQTL定位已經(jīng)被成功應(yīng)用到多種植物中，如擬南芥[12]、玉米[13]和小麥[14]等，成為國際上一個新的研究熱點(diǎn)。在葡萄中，該方法也成功應(yīng)用到花色苷和原花色素合成關(guān)鍵調(diào)控基因挖掘中[15-16]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以不同發(fā)育時期雜交后代群體及親本葡萄果實(shí)為材料，結(jié)合實(shí)時熒光定量基因表達(dá)分析技術(shù)和傳統(tǒng)的QTL定位方法，對7個單萜合成途徑關(guān)鍵基因（、、、和3個單萜合成酶基因、、）表達(dá)水平進(jìn)行eQTL分析，研究單萜的調(diào)控機(jī)制，挖掘出重要的調(diào)控基因位點(diǎn)，為優(yōu)良玫瑰香味葡萄新品種培育及種質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以2010年母本‘瑞都香玉’與父本‘摩爾多瓦’雜交構(gòu)建的F1代群體及親本為研究材料。‘瑞都香玉’屬于歐亞種，是北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院通過‘京秀’和‘香妃’雜交育成，果實(shí)黃綠色，果皮薄，果肉硬脆，具有濃郁的玫瑰香味，單萜含量較高[17]。父本‘摩爾多瓦’，歐美雜種，由葡萄品種‘Guzal Kara’和‘Villard blanc’雜交而得，1997年引入中國，沒有玫瑰香味，單萜含量低[18]。2011年對該群體進(jìn)行定植，共236株，從中隨機(jī)選出160個健壯單株構(gòu)建作圖群體。F1群體與親本單株均定植于北京市林業(yè)果樹科學(xué)院葡萄試驗(yàn)園內(nèi)（北緯39°58′，東經(jīng)116°13′），單臂籬架水平龍干整形，株行距0.75 m×2 m，南北走向，采用簡易避雨、地表園藝地布覆蓋、滴灌供水和常規(guī)病蟲害等管理模式，生長期內(nèi)修剪及肥水管理一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 于2018年對F1代群體及親本進(jìn)行果實(shí)樣品采集。研究表明玫瑰香型葡萄果實(shí)單萜化合物積累從轉(zhuǎn)色期開始[19-20]，基于此，本研究取樣主要分為兩個時期：轉(zhuǎn)色期和成熟期。因?yàn)殡s交群體各個樣本的轉(zhuǎn)色和成熟時間都不相同，依據(jù)往年物候期記載，轉(zhuǎn)色時間主要分布在6月下旬至7月中旬，每5 d對樣本植株的果實(shí)成熟度進(jìn)行跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)果實(shí)轉(zhuǎn)色后（50%果粒變紅或者變軟）隨即進(jìn)行取樣。果實(shí)的成熟期根據(jù)果實(shí)種子顏色變褐狀況并結(jié)合可溶性固形物含量（°Brix≥16）進(jìn)行判斷。成熟時間主要分布在8月中旬至9月下旬，與轉(zhuǎn)色期取樣一致，每5 d對果實(shí)成熟度進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)果實(shí)成熟隨即進(jìn)行取樣。

在每一雜交株上隨機(jī)選取3穗果實(shí)，每一穗從不同位置選取大約10—20個果實(shí)作為一個重復(fù)。采收后樣品用液氮速凍，放入-80℃冰箱中冷凍保存。

兩個親本不同發(fā)育時期果實(shí)樣品采集分為3個時期：幼果期（花后20 d），轉(zhuǎn)色期（50%果粒變紅或者變軟）和成熟期（°Brix≥16），在兩個親本品種上隨機(jī)取3—5穗果實(shí)，每一穗從不同位置選取大約15—20個果實(shí)作為一個重復(fù)，每個時期采3個重復(fù)，采集后馬上用液氮速凍，置于-80℃冰箱中備用。

1.2.2 RNA提取和cDNA合成 取大約10粒葡萄果實(shí)置于預(yù)冷的研缽中，在液氮保護(hù)條件下將葡萄碾碎、去籽去梗，磨成粉末，取1 g粉末用于總RNA提取，總RNA提取采用植物RNA快速提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）進(jìn)行，提取步驟詳見試劑盒說明書。RNA質(zhì)量和濃度采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 3300（Eppendorf）進(jìn)行檢測。然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，A3500），參照說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR分析 利用伯樂CFX 96實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，Richmond，CA）分析轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Green RT-PCR Master Mix（ABI 4385612），1 μL cDNA，和0.5 μL引物，8 μL ddH2O，共20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20 s，95℃ 10 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)。

基因表達(dá)相對定量分析采用2-ΔΔCT法，選取和內(nèi)參基因作為葡萄果實(shí)基因表達(dá)的參比標(biāo)準(zhǔn)。每個基因PCR擴(kuò)增有3個重復(fù)。在單萜生物合成途徑中7個關(guān)鍵基因及內(nèi)參基因的引物序列參照孫磊等[21]的方法合成。

1.2.4 單萜合成基因eQTL檢測 基于已經(jīng)構(gòu)建好的葡萄高密度遺傳圖譜[22]，采用QTL分析軟件mapQTL6.0[23]及區(qū)間作圖法，進(jìn)行eQTL定位和效應(yīng)分析，首先通過PT檢驗(yàn)1 000次設(shè)定LOD閾值，先考慮0.99置信度對應(yīng)的閾值，若沒有定位區(qū)間則考慮0.95置信度對應(yīng)的閾值；若沒有定位區(qū)間則考慮0.90置信度的閾值。若仍沒有結(jié)果則不考慮PT檢驗(yàn)的結(jié)果，手動降低LOD閾值到3.0；若3.0沒有區(qū)間則降到2.5；若2.5沒有區(qū)間則降到2。確定主要eQTL，并將eQTL連鎖標(biāo)記定位到基因組區(qū)域，通過Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋；如果在此區(qū)間內(nèi)存在單萜合成基因則該eQTL為-eQTL，表明基因自身定位于此；如果此區(qū)段未發(fā)現(xiàn)單萜合成基因，則該eQTL為-QTL，表明該eQTL可能為該基因上游調(diào)控基因的所在位點(diǎn)。

1.2.5 基因表達(dá)芯片檢測 親本不同發(fā)育時期果實(shí)樣品總RNA采用QIAGEN的Micro Kit試劑盒純化（加入PolyA control），具體步驟參照說明書；cDNA合成使用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit；之后采用Affymetrix Gene Chip Sample Cleanup Module進(jìn)行純化；cDNA標(biāo)記使用Affymetrix Gene Chip IVT Labeling Kit，純化使用Affymetrix Genechip Sample Cleanup Module，所有操作參考說明書。本研究所用的葡萄基因芯片為美國Affymetrix公司基因芯片（GeneChip?Genome Array）。葡萄基因芯片與樣品雜交由北京中康博科技有限公司完成，具體雜交過程按照芯片雜交要求完成。芯片雜交信號數(shù)據(jù)采用GeneChip 3000 7G掃描儀進(jìn)行掃描。掃描儀通過捕獲熒光信號，并通過GCOS軟件將信號轉(zhuǎn)化，從而獲得每個探針的信號值，生成CEL文件。差異表達(dá)的基因使用Ensemble plant、NCBI和Swissprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用分析軟件Excel 2007，采用SPSS 13.0進(jìn)行Spearman和Pearson相關(guān)性分析，差異顯著水平＜0.05；聚類分析采用MetaboAnalyst 5.0[24]；繪圖采用Sigma Plot 10.0。

2 結(jié)果

2.1 雜交后代及親本果實(shí)單萜合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)遺傳規(guī)律分析

由圖1-A可見，在轉(zhuǎn)色期，大部分單萜合成途徑基因在雙親中的表達(dá)并不存在明顯差異，父本‘摩爾多瓦’中的表達(dá)水平略高于母本‘瑞都香玉’。F1群體中均表現(xiàn)連續(xù)的分布模式，呈現(xiàn)多基因控制的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)。到成熟期，除了，大部分檢測基因的表達(dá)水平高于轉(zhuǎn)色期，且母本‘瑞都香玉’中的表達(dá)水平明顯高于父本，在F1雜交后代中也表現(xiàn)連續(xù)的分布模式（圖1-B）。進(jìn)一步對各個基因成熟期與轉(zhuǎn)色期表達(dá)量比值進(jìn)行分析，在果實(shí)成熟過程中，各個基因在‘瑞都香玉’中的表達(dá)變化明顯高于父本‘摩爾多瓦’，并且在F1群體中呈現(xiàn)連續(xù)分布的數(shù)量遺傳特征（圖1-C）。

兩個不同發(fā)育時期的這7個單萜合成基因之間均存在顯著的正相關(guān)（表1）。轉(zhuǎn)色期，各個單萜基因之間相關(guān)系數(shù)在0.40—0.91；成熟期，各個單萜基因之間相關(guān)系數(shù)在0.34—0.94。相較于其他單萜合成相關(guān)基因，的相關(guān)系數(shù)較低（轉(zhuǎn)色期0.40—0.65，成熟期0.34—0.47），可能該基因存在不一樣的調(diào)控位點(diǎn)。不同單萜合成途徑基因之間具有非常顯著的相關(guān)性，表明它們之間不是互相獨(dú)立的，推測它們可能具有相同的上游調(diào)控基因。

2.2 單萜合成途徑關(guān)鍵基因eQTL分析

基于7個單萜合成途徑基因在后代群體轉(zhuǎn)色期和成熟期果實(shí)中的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用父母本整合圖譜進(jìn)行eQTL分析。由表2可知，在轉(zhuǎn)色期，7個基因表達(dá)性狀一共定位到13個eQTL，主要位于1號、6號、14號、16號、17號、10號和12號等染色體上，表型解釋率介于12.2%—23.5%。其中檢測到3個eQTL（qDXS1-v1、qDXS1-v6和qDXS1-v14），分別位于1號、6號和14號染色體，表型解釋率為17%、15.7%和15.9%；也定位到3個eQTL：qDXS3- v12、qDXS3-v16和qDXS3-v17，分別位于12號、16號和17號染色體，表型解釋率介于16.4%—23.5%；與表達(dá)量連鎖的eQTL有1個（qDXR-v17），位于17號染色體上標(biāo)記Marker179340和Marker108104之間，解釋率為14.4%；在14號染色體檢測到2個eQTL（qHDR-v14-1和qHDR-v14-2），表型解釋率分別為16.7%和15.6%；而3個單萜合成酶基因、和均在10號染色體檢測到eQTL（qLiner-v10、qTerp-v10和qGermD-v10），解釋率介于13.7%—16%，這3個eQTL共定位到相同的遺傳區(qū)間146.183—148.835 cM，說明在這個位點(diǎn)可能存在同時調(diào)控3個基因表達(dá)的重要基因。此外，還在14號染色體檢測到1個eQTL（qTerp-v14），這個eQTL與qDXS1-v14和qHDR-v14-1定位到相同的遺傳區(qū)間57.582—76.979 cM，說明這個位點(diǎn)可能與和這兩個基因表達(dá)相關(guān)。

A：轉(zhuǎn)色期；B：成熟期；C：成熟期與轉(zhuǎn)色期表達(dá)量比值；“*”代表父本‘摩爾多瓦’；“▽”代表母本‘瑞都香玉’

表1 單萜合成相關(guān)基因相對表達(dá)之間的相關(guān)性分析

左下：成熟期；右上：轉(zhuǎn)色期 Bottom left: Mature stage; Top right: Verasion stage

表2 中性圖譜單萜合成相關(guān)基因eQTL信息

在成熟期，7個基因的表達(dá)量性狀數(shù)據(jù)共定位到16個eQTL，主要位于1號、6號、12號、8號、13號、3號和19號等染色體（表2）。其中與和相連鎖的eQTL位于1號、6號和12號染色體，qDXS1-m1和qDXR-m1、qDXS1-m6-1和qDXR-m6-1、qDXS1-m6-2和qDXR-m6-2、qDXS1-m12和qDXR-m12均定位到相同遺傳區(qū)域，該區(qū)間可能有共同的基因調(diào)控這兩個基因的表達(dá)；相關(guān)eQTL位于3號染色體，介于Marker831346和Marker700177之間，解釋率13.9%；與表達(dá)量相關(guān)的eQTL分別位于8號（qHDR-m8）和13號（qHDR-m13）染色體；和表達(dá)量也在6號染色體定位到eQTL，說明6號染色體上存在調(diào)控單萜合成的關(guān)鍵基因；與連鎖的eQTL位于7號和19號染色體。

進(jìn)一步以成熟期與轉(zhuǎn)色期各個基因的表達(dá)量比值變化作為表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在遺傳圖譜上共檢測到18個eQTL，分別位于1號、3號、7號、10號、12號、15號和19號等染色體（表2）。qDXS1-r12-1、qDXR-r12-1、qHDR-r12、qLiner-r12和qGermD-r12覆蓋相同的遺傳區(qū)間6.330—6.967 cM，在此位點(diǎn)可能存在重要因子調(diào)控這些基因的表達(dá)。和均在3號染色體檢測到覆蓋相同遺傳區(qū)間的eQTL（qDXS3-r3和qGermD-r3）；和這兩個基因分別在19號染色體上檢測到qLiner-r19和qTerp-r19，覆蓋相同的遺傳區(qū)間。

此外，在不同的發(fā)育時期，7個基因的表達(dá)性狀檢測到不同的遺傳位點(diǎn)（表2）。在轉(zhuǎn)色期與相連鎖的eQTL位于1號、6號和14號染色體，而在成熟期檢測到的eQTL主要位于1號、6號和12號染色體。但是位于6號染色體的qDXS1-m6-2與轉(zhuǎn)色期eQTL位點(diǎn)qDXS1-v6覆蓋相同遺傳區(qū)間，說明在6號染色體上存在調(diào)控表達(dá)的基因，且該基因可能在整個果實(shí)成熟期發(fā)揮作用；其余6個基因在2個不同發(fā)育時期并未檢測到相同的遺傳調(diào)控位點(diǎn)。

不同于傳統(tǒng)的數(shù)量性狀位點(diǎn)定位，表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)分析還可以鑒定表達(dá)性狀變異的調(diào)控模式即順式作用（-）或反式（-）調(diào)控。本研究所檢測的7個單萜合成途徑基因、、、、和分別位于5號、4號、17號、3號、13號和18號染色體上，而（）并未錨定到任何一個染色體[1]。綜上，并未在這7個單萜合成相關(guān)基因所分布染色體相關(guān)區(qū)域檢測到連鎖的eQTL，所檢測到的eQTL均是-類型。

2.3 關(guān)鍵候選基因的挖掘

利用已公布的葡萄基因組序列信息，將與多個單萜合成基因表達(dá)量相關(guān)的eQTL位點(diǎn)連鎖標(biāo)記定位到葡萄基因組上，在對應(yīng)基因組區(qū)域內(nèi)提取基因，根據(jù)這些基因的功能注釋分析結(jié)果，篩選區(qū)域內(nèi)所有的轉(zhuǎn)錄因子及與萜類合成相關(guān)的基因共90個（圖2）。為了進(jìn)一步確定可能的候選基因，對兩個親本不同發(fā)育時期的樣品進(jìn)行全基因組芯片檢測。將單萜合成途徑基因及候選轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行共表達(dá)分析（圖2），發(fā)現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育過程中，和在早期表達(dá)量高，后期表達(dá)量隨著果實(shí)成熟而降低，其中候選基因和等表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式；其余5個單萜合成基因表達(dá)模式聚為一類，隨著果實(shí)成熟則表達(dá)量升高，包含等在內(nèi)的10個候選基因的表達(dá)模式與其一致（圖2）。

進(jìn)一步依據(jù)各個基因表達(dá)量進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，并針對每一個單萜合成基因篩選出與之表達(dá)相關(guān)度最高的20個基因（圖3），與高度關(guān)聯(lián)的候選基因有、、、、、、、、、、和等。其中和等8個基因與和等相關(guān)系數(shù)也較高，而、和等這些候選基因也與單萜合成酶基因（、和）的表達(dá)高度相關(guān)。但是和高度關(guān)聯(lián)的候選基因與其他單萜合成基因表達(dá)的相關(guān)度并不高，這與eQTL定位結(jié)果相一致，可能其具有不同的調(diào)控基因位點(diǎn)。將高相關(guān)度的基因進(jìn)行兩兩比對分析，最終篩選出與多個單萜基因表達(dá)高度相關(guān)的潛在候選基因11個（表3），其中4個候選基因（、、和）與激素信號通路調(diào)控相關(guān)，一個候選基因（）編碼光敏色素作用因子與光響應(yīng)相關(guān)，還有一些編碼Myb類、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子或者未知功能蛋白。

MA：幼果期‘摩爾多瓦’樣品；MB：轉(zhuǎn)色期‘摩爾多瓦’樣品；MC：成熟期‘摩爾多瓦’樣品；RA：幼果期‘瑞都香玉’樣品；RB：轉(zhuǎn)色期‘瑞都香玉’樣品；RC：成熟期‘瑞都香玉’樣品

圖3 與單萜合成途徑基因表達(dá)高相關(guān)的候選基因

表3 eQTL位點(diǎn)可能的候選基因

3 討論

3.1 單萜合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)性狀遺傳特點(diǎn)

單萜是葡萄果實(shí)中重要的異戊二烯衍生物，是玫瑰香型葡萄的典型香氣成分。因此其合成調(diào)控機(jī)制引起科學(xué)家廣泛關(guān)注。研究者先后利用不同親本雜交后代群體，在5號染色體定位到一個調(diào)控5種單萜含量的主效QTL[3-4]，進(jìn)一步確定單萜合成途徑入口酶為調(diào)控葡萄果實(shí)單萜合成的關(guān)鍵基因[5-6]。盡管取得了一些進(jìn)展，但是以往的研究表明葡萄中單萜的積累涉及復(fù)雜的多基因調(diào)控[3-4,22]。除了外，還有其他重要的調(diào)控基因位點(diǎn)有待進(jìn)一步挖掘。大量研究表明葡萄果實(shí)單萜含量差異與相關(guān)基因表達(dá)水平有著必然聯(lián)系[2,19,25]。本研究選擇了單萜合成途徑中的7個關(guān)鍵基因，檢測了它們在親本與雜交群體中表達(dá)水平變化，除了，大部分單萜合成基因在成熟期表達(dá)升高，且在高含量單萜親本‘瑞都香玉’中的表達(dá)水平明顯高于低含量單萜親本‘摩爾多瓦’，這與單萜積累相一致。之前的研究發(fā)現(xiàn)，由于DXS1是單萜合成途徑入口酶，其表達(dá)高峰往往早于化合物積累高峰[20,25]，這可能是導(dǎo)致并未檢測到高表達(dá)的原因。各個單萜基因表達(dá)水平在雜交后代中呈現(xiàn)較大變異范圍，在兩個發(fā)育時期均出現(xiàn)超親現(xiàn)象，有遺傳的加性效應(yīng)。來自多個雜交群體化合物測定數(shù)據(jù)顯示，單萜化合物合成在后代中存在超親遺傳，個別化合物在雜交后代中超親率較高，在遺傳效應(yīng)上呈典型的增強(qiáng)變異[8-10]，這與本試驗(yàn)基因表達(dá)結(jié)果部分一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在不同果實(shí)發(fā)育期，7個單萜合成基因表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性（表1）。前期研究也曾指出許多植物萜類代謝途徑的相關(guān)基因有共表達(dá)的現(xiàn)象，推測可能受同一個家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[26]。

3.2 單萜合成途徑關(guān)鍵基因QTL位點(diǎn)

本研究共定位到37個eQTL位點(diǎn)，其中位于14號、6號和12號等染色體上的遺傳位點(diǎn)與多個單萜基因表達(dá)相關(guān)，可能存在重要的共調(diào)控因子。劉翠霞[8]以單萜化合物含量為表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL分析，也分別在6號、12號和14號染色體鑒定到與多個化合物含量連鎖的QTL位點(diǎn)，且位于6號和12號染色體的QTL位點(diǎn)物理位置與本研究結(jié)果相近。劉若瑾[10]利用關(guān)聯(lián)分析在12號染色體檢測到與單萜化合物含量相關(guān)的遺傳基因位點(diǎn)。目前關(guān)于單萜合成相關(guān)基因表達(dá)層面遺傳定位研究較少。Huang等[15]對葡萄花色苷合成途徑花青素糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了eQTL定位分析，鑒定到一個位于本身的-eQTL和一個-eQTL，該-eQTL與轉(zhuǎn)錄因子MYBAs共定位。同時對5個參與原花色素合成的基因進(jìn)行了eQTL分析，定位到4個-eQTL和17個-eQTL[16]。但是本研究所檢測到的eQTL均是-類型，說明單萜各個基因表達(dá)水平的變化并不是由自身基因結(jié)構(gòu)變化引起，而是存在另外的上游調(diào)控因子影響單萜基因的表達(dá)，并且存在可以調(diào)控多個單萜合成相關(guān)基因表達(dá)的位點(diǎn)。

3.3 候選基因鑒定

轉(zhuǎn)錄因子作為植物次生代謝途徑的上游調(diào)控元件，往往能夠?qū)ο掠未x途徑中的多個關(guān)鍵酶同時進(jìn)行調(diào)控，通過轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制萜類合成相關(guān)酶基因的表達(dá)可以促進(jìn)萜烯類物質(zhì)的合成[27]。因此，本研究著重對共定位區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析，共注釋到90個候選轉(zhuǎn)錄因子基因，并鑒定到、、、、、和等這些候選基因與多個單萜合成基因的表達(dá)高度相關(guān)；基因功能注釋顯示和為乙烯信號通路重要基因（表3）。Sarker等[28]研究發(fā)現(xiàn)乙烯響應(yīng)因子ERF-1和ERF-2會影響薰衣草中單萜物質(zhì)芳樟醇及其衍生物合成；甜橙AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子ERF71能夠通過與萜烯合成酶基因的啟動子結(jié)合從而促進(jìn)揮發(fā)性單萜香葉醇的合成[29]。這些研究表明乙烯信號通路在單萜合成調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。ERF家族轉(zhuǎn)錄因子是乙烯代謝路徑中的響應(yīng)因子，可以影響呼吸躍變型果實(shí)的成熟進(jìn)度[30]。葡萄屬于非呼吸躍變植物，對乙烯并不敏感，但是其在葡萄果實(shí)發(fā)育和成熟過程中也起著關(guān)鍵的作用[31]。目前，已經(jīng)在葡萄中鑒定出149個AP2/ERF家族成員，其中50個AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因在葡萄果實(shí)從轉(zhuǎn)色到成熟過程中的表達(dá)發(fā)生顯著變化[32]，而這個時期也是果實(shí)單萜積累的關(guān)鍵階段[19-20]，二者可能存在較大的關(guān)聯(lián)性。Cramer等[31]和Wen等[19]通過轉(zhuǎn)錄組測序研究發(fā)現(xiàn)在16號染色體上的一組ERF6類轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控葡萄萜烯積累。但是本研究并未在16號染色體檢測到主效eQTL位點(diǎn)，可能因?yàn)闄z測方法和供試材料遺傳背景不同所致。此外，和編碼Myb類轉(zhuǎn)錄因子蛋白，編碼WRKY 6類轉(zhuǎn)錄因子蛋白。Myb類轉(zhuǎn)錄因子被報道是與植物萜烯類化合物代謝相關(guān)的6個主要TFs家族成員之一[33]。Costantini等[25]通過轉(zhuǎn)錄組測序方法，也在14號染色體篩選到可能與單萜合成調(diào)控有關(guān)的編碼MYB24轉(zhuǎn)錄因子的候選基因。Li等[34]報道一個WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子WRKY40通過GT14參與調(diào)控葡萄果實(shí)糖苷結(jié)合態(tài)單萜合成。還有一些已被報道的可能參與調(diào)控葡萄果實(shí)中單萜合成的轉(zhuǎn)錄因子如GATA 5Tike、GT-2、NAC等[19,25]，但是本研究中并未檢測到。

在高等植物中，影響類異戊二烯生物合成的重要信號之一是光，它在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平激活MEP途徑[35]。前期研究表明光照可以在整個發(fā)育過程影響葡萄果實(shí)萜烯合成和積累，避光處理后單萜含量會降低[36]。已有報道發(fā)現(xiàn)HY5（長軸蛋白5，）在葡萄光誘導(dǎo)萜類生物合成調(diào)控中發(fā)揮重要作用[37]。本研究發(fā)現(xiàn)候選基因編碼光敏色素作用因子蛋白PIF5，而研究表明PIF轉(zhuǎn)錄因子往往與HY以分子模塊形式發(fā)揮作用[38-39]。后續(xù)研究將進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除等技術(shù)對這些候選基因進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

基于構(gòu)建好的葡萄高密度遺傳圖譜，在2個不同生長發(fā)育期，對‘摩爾多瓦’ב瑞都香玉’F1代群體共檢測到37個與單萜合成途徑基因表達(dá)相關(guān)的eQTL，主要定位于6號、12號和14號染色體。基于基因注釋和表達(dá)譜分析，篩選到了包含和在內(nèi)的11個可能的候選基因，這些候選基因與多個單萜基因表達(dá)高度相關(guān)。

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eQTL Analysis of Key Monoterpene Biosynthesis Genes in Table Grape

WANG HuiLing1, YAN AiLing2, SUN Lei3, ZHANG GuoJun1, WANG XiaoYue1,REN JianCheng1, XU HaiYing1*

1Institute of Forestry and Pomology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100093;2Beijing Engineering Research Center for Deciduous Fruit Trees, Beijing 100097;3Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100097

【Objective】The eQTL mapping for monoterpene biosynthesis related gene expression traits were performed and the candidate genes were mined to deeply understand the regulation mechanism of monoterpene synthesis, so as to lay a foundation for the cultivation of new Muscat grape varieties and germplasm improvement.【Method】The F1population generated by crossing Moldova and Ruiduxiangyu were used as materials in this study, and the grape berry samples were collected at verasion and ripening stage respectively.The phenotypic data of expression traits were obtained by detecting the expression levels of seven monoterpene synthesis pathway genes (,,,,,, and) by using real-time quantitative qPCR technique.eQTL mapping of monoterpene gene expression traits were performed with the mapQTL6.0 software based on the interval mapping method.The associated markers of eQTL were mapped to the genomic region, and the genes within eQTLs were annotated and analyzed via the databases of Ensembl Plants and NCBI.The expression profiles of candidate genes in the samples of parents at different developmental stages were detected by grape whole genome microarray.【Result】The expression levels of seven monoterpene biosynthesis related genes in F1population showed a continuous quantitative genetic distribution.A significant correlation between the expression of monoterpene genes was observed.At verasion, 13 eQTLs for the seven expression traits were mapped on chromosome 1, 6, 14, 16, 17, 10 and 12, respectively, and the phenotypic explanation value ranged from 12.2% to 23.5%.Among them, eQTLs (qDXS1-v14, qHDR-v14-1 and qTerp-v14) on chromosome 14 covered the same genetic interval of 57.582-76.979 cM, and qLiner-v10, qTerp-v10 and qGermD-v10 were co-located on chromosome 10.At the mature stage, 16 eQTLs were detected, mainly located on chromosome 1, 6, 12, 8, 13 and 19.qDXS1-m6-2, qDXR-m6-2, qLiner-m6 and qGermD-m6 were co-located in the genetic interval 139.212-143.161 cM of chromosome 6.In addition, a total of 18 eQTLs on chromosomes 1, 3, 7, 10, 12, 15 and 19 were detected for the change ratio of each gene expression between maturity and verasion, respectively.qDXS1-r12-1, qDXR-r12-1, qHDR-r12, qLiner-r12 and qGermD-r12 covered the same genetic interval of 6.330-6.967cM on chromosome 12.The eQTL region for multiple expression traits co-located were further annotated, 90 transcription factor genes were screened, and 11 candidate genes were finally identified by expression profile and correlation analysis.Among them, four candidate genes of,,andwere predicted to participate in the regulation of hormone signaling pathway, one candidate geneencodes a phytochrome interacting factor related to light response, and some other genes encode Myb, WRKY transcription factors or unknown functional proteins.【Conclusion】A total of 37 eQTLs linked to monoterpene synthesis gene expression traits were detected at two different development stages, which mainly located on chromosome 6, 12 and 14.Based on the results of gene annotation and expression profile analysis, 11 candidate genes includingandwere identified, and these candidate genes were highly correlated with the expression of multiple monoterpene genes.

grape; monoterpenes; key genes; eQTL

2021-05-17；

2021-07-27

北京市自然科學(xué)基金（6182007）、國家自然科學(xué)基金青年基金（31601712）、北京市農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（kjcx20200406）、財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-29）

王慧玲，E-mail：wanghui198216@126.com。通信作者徐海英，Tel：010-82592156；E-mail：haiyingxu63@sina.com

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