羅翠婷　 江富祥　董芬　曹莉

摘要：本研究以火棘果為原料，利用乙醇溶液提取其中的多酚，采用福林酚法測定多酚的含量。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化多酚的提取工藝。結(jié)果表明火棘果中多酚的最佳提取工藝為： 料液比為1：12（g：mL），乙醇濃度為73%，PH為3.6，溫度為80℃，提取時(shí)間60min，提取次數(shù)為2次。依照優(yōu)化條件的工藝，得到的多酚平均值為13.575 mg/g，與回歸方程計(jì)算得到的理論值響應(yīng)值13.756 mg/g基本吻合，該研究為有效地利用我國火棘這一豐富的野生資源提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：火棘;多酚類物;提取;響應(yīng)面分析

火棘（Pyracantha fortuneana （Maxim） Li.）為薔薇科火棘屬植物，又名火把果、救命糧、赤陽子等，其分布很廣，多分布在亞洲東部至歐洲南部?；鸺粌H具有觀賞價(jià)值，同時(shí)它也是重要的天然色素、果膠及飼料資源，而且它的果實(shí)的營養(yǎng)豐富，具有食用價(jià)值和藥用價(jià)值。研究表明火棘果具有較強(qiáng)的抗疲勞、降血脂、保護(hù)心肌、消食健脾和通便潤腸功效，同時(shí)可以滋潤及美白皮膚。

植物多酚是植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝物，具有多元酚結(jié)構(gòu)。多酚是火棘果重要的藥效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒的作用。目前對火棘果的研究主要集中在多糖、黃酮及原花青素等方面，而對其中多酚的提取及相關(guān)報(bào)道相對較少。另外，由于成分化學(xué)結(jié)構(gòu)不明確，藥效成分的開發(fā)研究不夠深入，限制了多酚在功能性食品和醫(yī)藥制品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，進(jìn)而制約了火棘果中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對火棘果多酚提取工藝進(jìn)行探討，為充分利用火棘果多酚提供依據(jù)，這對于火棘果資源的深度開發(fā)和綜合利用具有極大的促進(jìn)作用。

1材料與方法

1.1材料與試劑

火棘果：采摘湖北恩施來鳳地區(qū)。

標(biāo)準(zhǔn)品：沒食子酸（特級），上海源葉生物科技有限公司。

其它試劑：無水碳酸鈉、濃鹽酸、無水乙醇、正丁醇、丙酮、甲醇（以上均為分析純）、Foline-pheno。

1.2儀器

數(shù)字酸度計(jì)：杭州東星儀器廠;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司;754型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼科（上海）儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電熱恒溫水浴鍋：武漢琴臺醫(yī)療器械廠;臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠;電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用10ml乙醇溶解0.5g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至100mL，然后分別移取0、1、2、3、5、10ml到100ml容量瓶中，用蒸餾水定容，分別稀釋成0、50、100、150、250、500mg/ml的溶液。用移液管分別移取20uL稀釋溶液到每個(gè)比色皿中，依次加入1.58mL水、100uL Foline-pheno試劑搖勻，等30s到8min，加入300uLNaCO 溶液搖勻，置于40℃恒溫水浴鍋中30min，顯色后于765nm波長下測定其吸收度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得回歸方程A=0.0052C+0.0664，其中R=0.9955，表明質(zhì)量濃度為0～0.005 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。

1.3.2火棘樣品中多酚含量測定

用移液管移取2.5ml樣品于25mL容量瓶中，精密吸取待測液20uL到比色皿中，依次加入1.58mL水、100uL Foline-pheno試劑搖勻，等30s到8min，加入300uLNaCO 溶液搖勻，置于40℃恒溫水浴鍋中30min，顯色后于765nm波長下測定其吸收度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。

2結(jié)果與分析

2. 1單因素試驗(yàn)

稱取火棘果皮肉粉10g，以乙醇為提取溶劑，一定料液比及提取溫度，回流提取一定時(shí)間后，冷卻至室溫后，分別過濾后定容至一定體積，用分光光度計(jì)在765nm處測定各浸提液的吸光度值。分別依次考察了乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、pH值及提取次數(shù)對原花青素提取得率的影響，結(jié)果分別見圖1～圖6。

由圖1可知：隨著乙醇濃度的提高，多酚化合物的提取率呈上升的趨勢，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)多酚化合物提取率最高，之后隨著濃度的增加，提取率反而降低。這是因?yàn)楫?dāng)高于此濃度后醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，多酚溶出量相對減少，故選70%的乙醇為提取條件。

由圖2可知：20～80℃時(shí)，多酚提取率隨溫度的升高而增大，在80℃時(shí)多酚得率最高。這是由于隨著溫度升高，多酚的滲透、溶解、擴(kuò)散速度也加快，使其溶解度增加。但是高溫會促進(jìn)多酚氧化分解，使其提取率下降。因此，火棘中多酚提取溫度不宜過高，提取溫度80 ℃最合適。

由圖3可知：隨著時(shí)間的增加，多酚的提取率不斷升高，在60min達(dá)到最大值，隨后趨于穩(wěn)定。因?yàn)槎喾踊衔镏心承岱€(wěn)定性差的成分會分解或在空氣中被氧化，導(dǎo)致提取率降低，因此，提取時(shí)間為60min最合適。

由圖4可知：多酚得率隨料液比的增長呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢，表明當(dāng)料液比增大到1：10（g：mL）時(shí)原料中的多酚已被充分提取出來，多酚得率達(dá)到峰值，因而繼續(xù)增大料液比，多酚得率不會明顯提高。綜合考慮成本及后續(xù)濃縮處理，料液比選取1：10（g：mL）較為合適。

由圖5可知：酸性條件更有利于多酚的提取，其主要是因?yàn)樗峥善茐牡鞍踪|(zhì)、多糖、纖維素與多酚的結(jié)合，從而提高多酚的提取率和提取速度。但過度酸化，會造成多酚酸解沉淀，多酚提取率反而下降，因此選取pH為3左右較合適。

由圖6可知：多次提取能增加多酚的提取量，但兩次提取已基本提取完全，再增加提取次數(shù)，提取量較少，而且隨著提取時(shí)間加長卻相反的引起多酚物質(zhì)的分解，降低提取量，其他雜質(zhì)成分也溶出增多，確定本次實(shí)驗(yàn)提取兩次。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案

根據(jù)Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取對火棘果多酚影響顯著的3個(gè)因素：投料比，乙醇濃度，PH值進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化考察，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表 1。

以X1（投料比）、X2（乙醇濃度）、X3（PH值）為自變量，以火棘果多酚提取率為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2模型的建立及顯著性檢查

利用design-expert7.1.6統(tǒng)計(jì)軟件對上表數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為：

Y=-608.72039+4.92928X1+19.23890X2+8.16980X3+0.10904X1X2-0.34447X1X3+0.068925X2X3-0.49230 X1-0.14228 X2-1.26057 X3

從表回歸方程模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知模型一次項(xiàng)X1、X2、X3，二次項(xiàng)X1、X2、X3，交互項(xiàng)X1X3、X1X2對響應(yīng)極顯著影響，X2X3對響應(yīng)值顯著影響，表明料液比、乙醇濃度、PH值對多酚提取的主效應(yīng)明顯，且在料液比、乙醇濃度和PH之間都存在交互作用。此外，F(xiàn)（X1）>F（X2）>F（X3）表明所選的3個(gè)因素中，投料比對多酚提取率影響最大，乙醇濃度次之，PH值相對最小。從該方程的方差分析可知本試驗(yàn)所選模型不同處理間差異極顯著 P<0.0001，失擬項(xiàng)Lack of Fit =0.6584>0.05，說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的即這種試驗(yàn)方法是可靠的，擬合情況好，可用此模型對火棘果多酚的提取進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.3響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件的確定

采用design-expert7.1.6統(tǒng)計(jì)軟件繪制響應(yīng)面圖及等高線，結(jié)果見圖10和圖11。由圖10可知，料液比和乙醇濃度對火棘果中多酚提取率的影響最為顯著，在料液比為7.5～12.5（g：mL），乙醇濃度為65%～75%交互作用下所得的多酚得率最高。

通過響應(yīng)面分析，可得三個(gè)因子的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)代碼值為（0.33149，0.262916，0.292138），變換為真實(shí)值即為：料液比為11.65745（g：mL），乙醇濃度為72.62916%，PH值為3.584276，在此條件下提取的多酚是最好的，理論值可達(dá)13.756 mg/g。

2.2.4回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果得多酚的平均含量為13.575mg/g，實(shí)驗(yàn)值與模型的理論值13.756mg/g非常接近，說明優(yōu)化提取條件重現(xiàn)性良好，此響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型是合理可靠的，對實(shí)際工藝操作具有一定的指導(dǎo)意義。

3.結(jié)論

本研究建立了一個(gè)以火棘果多酚提取量為考察指標(biāo)，以投料比、乙醇濃度、PH值、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)為評價(jià)因素，通過中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，建立響應(yīng)面模型。利用 Design-Expert 7.1.6軟件對回歸方程進(jìn)行優(yōu)化計(jì)算，確定了火棘果中多酚的最佳提取工藝條件：料液比為1：12（g：mL），乙醇濃度為73%，PH=3.6，溫度為80℃，提取時(shí)間60min，提取次數(shù)為2次。在此工藝條件下，多酚提取值為13.575 mg/g，與理論值響應(yīng)值13.756mg/g基本吻合，進(jìn)一步說明了響應(yīng)面法優(yōu)化提取火棘多酚是可行的，適合于提取火棘果中多酚工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 葉萌.我國火棘資源研究現(xiàn)狀及展望[J].四川林業(yè)科技，1999， 20（1） ： 60-63.

[2] 曾令貴，鐘露苗.火棘的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用概況[J].中國藥事，2009， 23（10）：1021-1023.

[3] 何志勇，夏文水.火棘果多酚的提取研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 2007， 27（1）：77-80.

[4] 楊亞麗，呼天明，劉洪瑜.普那菊苣酚類化合物提取工藝的研究[J].西北林學(xué)院報(bào)， 2006，21（5）：156-159.

[5] 曹煒，索志榮.Folin-Ciocalteu比色法測定蜂蜜中酚類化合物酸的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（12）：80- 82.

[6] 鄢又玉. 火棘原花青素制備及抗氧化功效研究[J].食品研究與開發(fā)， 2015， 36（4）：36-40.

[7] 吳偉.響應(yīng)面法優(yōu)化火棘果中多酚提取工藝[J].中國釀造，2015，34（12）：127-130.

[8] 楊亞麗.響應(yīng)曲面法優(yōu)化普那菊苣總酚類化合物提取工藝[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009，24（2）：118-120.

[9] 吳偉，李格，向福.響應(yīng)面法優(yōu)化福林酚法測定冬棗中總酚含量[J].食品工業(yè)， 2020， 41（04）： 86-90.

[10] 丁仲鵑，畢玉芬，戴云，雷雨. 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法優(yōu)化蜂膠總多酚提取工藝[J].食品科學(xué)， 2013， 34（02）：17-21.

作者介紹： 羅翠婷， 女，碩士研究生， 從事天然藥物化學(xué)、藥學(xué)教學(xué)研究.