◎ 高習(xí)嘉，許 天，唐鑫雨，霍黎黎，李國泰，薛長松

（1.通化師范學(xué)院吉林省長白山生物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 通化 134000；2.吉林基蛋生物科技有限公司，吉林 長春 130000；3.通化果真不凡科技開發(fā)有限公司，吉林 通化 134000）

酸漿（Physalis alkekengiL.）與毛酸漿（Physalis pubescens Lamarck）均屬茄科[1]。二者營養(yǎng)價(jià)值高，味道甜美、清香可口，果實(shí)內(nèi)含有多種維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和藥用成分，適合大眾消費(fèi)，是老少皆宜的可食用特色漿果[2-3]。目前對(duì)于二者的研究主要集中在化學(xué)成分研究、栽培技術(shù)、功能性應(yīng)用等方面[4]。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酸漿與毛酸漿染色體制片方法，對(duì)多個(gè)不同地區(qū)種源進(jìn)行體細(xì)胞染色體分析，擬從細(xì)胞水平上為酸漿、毛酸漿的新品種選育提供基礎(chǔ)研究參考依據(jù)，為酸漿、毛酸漿的功效評(píng)價(jià)篩選提供實(shí)驗(yàn)材料[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所選材料為多個(gè)地區(qū)酸漿屬市售或野外酸漿（紅菇蔦）與毛酸漿（黃菇蔦）種子，分別來源于吉林省、黑龍江省各地的種子市場(chǎng)或野外逸出種的采收。選取籽粒飽滿，大小均一的種子各若干份，每份20粒左右。

1.2 試驗(yàn)步驟

首先將種子置于60 ℃溫水中進(jìn)行燙種，待到水溫下降到室溫，取出，洗凈種子上的雜物。將被清洗過的種子放入事先配制好的0.1 mg·L-1赤霉素中，浸泡48 h，將其種皮軟化。軟化后將酸漿、毛酸漿種子取出，用濕潤的紗布將其包好，然后置于上下各墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，放入30～35 ℃恒溫箱，每過5 h換一次紗布，直至全部種子發(fā)芽，注意保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤，待根尖長至1 cm左右，取出，挑選其中品相完好，種牙沒有折斷的種子，備用。

1.2.1 預(yù)處理

在10:00或者15:00左右將備用的種子取出，小心剪取種子的根尖部位，把剪好的根尖放入對(duì)二氯苯飽和溶液進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)間為5～6 h。

1.2.2 固定

將預(yù)處理后的種子根尖放入無水乙醇∶冰醋酸=3∶1中固定10 h左右，注意讓根尖保持在液面之下，不能讓根尖干燥。固定后將根尖取出，將殘留在表面的試劑用濾紙輕輕擦凈，然后將種子放入放置有60%乙醇溶液的培養(yǎng)皿中，4 ℃低溫保存，備用。

1.2.3 解離

將固定好的根尖取出，擦凈，放入裝有1 mol·L-1的鹽酸溶液的錐形瓶中，在60 ℃水浴鍋解離，解離時(shí)間一般為6 min或7 min（以解離程度完全為度調(diào)整時(shí)間，解離時(shí)間最長可至12 min左右，最短為6 min左右），解離后取出，蒸餾水清洗，重復(fù)3次，每次5～10 min。

1.2.4 染色壓片

將清洗后的根尖取出，在載玻片上切取根尖前端1 mm分生區(qū)，放在另一片干凈的載玻片上，滴入改良石炭酸品紅染色液，輕輕蓋上蓋玻片染色，用一手拇指輕輕按壓固定蓋玻片，另一手拇指輕刮蓋玻片使細(xì)胞分散，用濾紙吸出多余染色液。設(shè)定3個(gè)染色時(shí)間分別為15 min、20 min、30 min，觀察染色情況，最后取染色度較好的時(shí)間段為染色標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間并適時(shí)調(diào)整。

1.2.5 顯微鏡觀察

將載玻片放在顯微鏡載物臺(tái)上，將根尖部位放置在光圈正中央，先用40倍物鏡找到清晰中期分裂相，再用100倍油鏡觀察清晰完整染色體，并記錄染色體染色情況，染色體條數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色條件優(yōu)選

酸漿（紅菇蔦）與毛酸漿（黃菇蔦）種子種皮較硬，在試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率過低，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。因此先考察了酸漿、毛酸漿種子萌發(fā)處理?xiàng)l件與方法，獲得了較好的萌發(fā)率。

對(duì)二氯苯飽和溶液是應(yīng)用廣泛的預(yù)處理試劑，處理細(xì)胞的機(jī)制是破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞周期停留在有絲分裂中期，得到良好的染色體制片，以便于進(jìn)行染色體的計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察[6]。用冰水混合物的處理作用效果同化學(xué)試劑相同，得到有絲分裂中期的染色體制片[7]?，F(xiàn)在也有越來越多的學(xué)者將預(yù)處理試劑混合使用[8]。本實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)上述情況進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于酸漿與毛酸漿，用對(duì)二氯苯飽和溶液4 ℃處理2個(gè)品種的根尖，作用效果明顯，染色體較為清晰，易于觀察染色體數(shù)目。

植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，不利于后期的染色和制片[9]。解離的作用機(jī)制是軟化細(xì)胞壁去除果膠[10]。對(duì)于不同的植物材料，解離液的選擇和解離時(shí)間均不相同。本實(shí)驗(yàn)中采用的是酸解方式，選用的解離液是1 mol·L-1HCl。作用效果明顯，解離后的細(xì)胞背景清晰。由于材料不同，解離時(shí)間也會(huì)有所不同。經(jīng)考察，本實(shí)驗(yàn)最終確定采用的是60 ℃酸解3～6 min，其中多數(shù)6 min的染色體圖像效果較佳。

實(shí)驗(yàn)過程中，由于諸多可變因素均可影響實(shí)驗(yàn)最終染色效果，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)染色時(shí)間以應(yīng)對(duì)諸多可變因素對(duì)實(shí)驗(yàn)最終染色效果的影響。每次實(shí)驗(yàn)中，按1.2.4設(shè)定的3個(gè)染色時(shí)間，分別在15 min、20 min、30 min時(shí)間段采樣，觀察染色情況進(jìn)行試驗(yàn)，選取染色度最佳的時(shí)間段作為該次實(shí)驗(yàn)染色時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本操作方法可以應(yīng)對(duì)試驗(yàn)過程中的復(fù)雜情況，獲得高效快捷的染色結(jié)果。同次實(shí)驗(yàn)過程中不同時(shí)間染色效果舉例見圖1（a）、圖1（b）和圖 1（c）。

2.2 染色體數(shù)目

如圖2（a）、圖2（b）所示，經(jīng)過觀察可以看出不同地區(qū)來源的與毛酸漿（黃菇蔦）與酸漿（紅菇蔦）染色體均為24條，且均為二倍體，都屬小型染色體。這與許亮等[7]和沙成卓等[9]報(bào)道的毛酸漿的結(jié)果一致，而且還與酸漿屬的掛金燈的染色體數(shù)目保持一致，均是以近中部著絲粒染色體和中部著絲粒染色體為主，這與其進(jìn)化過程相一致[11-12]。

3 結(jié)論

植物染色體的數(shù)目、形態(tài)等是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一，不同種的染色體有不同的數(shù)目、核型及體積等特征，表明了此種在系統(tǒng)演化的位置以及和相近種的親緣關(guān)系[13-15]。本研究結(jié)果表明，毛酸漿與同屬酸漿的染色體數(shù)目相似、核型相似，可為探討種間親緣關(guān)系提供參考，同時(shí)為酸漿與毛酸漿雜交、多倍體育種、篩選優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源以及具功能性的特色食品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。