◎ 蔡志靜，程江闖

（普研（上海）標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201318）

食品中的著色劑，即色素，可分為天然和合成兩大類，主要作用是使食品著色，改善感官顏色。其中，合成著色劑主要是通過化學(xué)物質(zhì)合成獲得，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)來分，有非偶氮類著色劑和偶氮類著色劑，食品中常用的偶氮類著色劑有檸檬黃、誘惑紅、莧菜紅、日落黃、偶氮玉紅和胭脂紅等；按照溶解性來分，有脂溶性著色劑和水溶性著色劑，目前飲料中使用的著色劑基本上都是水溶性著色劑[1]。水溶性著色劑相對(duì)于天然著色劑來說成本低、著色力強(qiáng)、易調(diào)色及穩(wěn)定性好，深受各類食品生產(chǎn)企業(yè)的青睞，但部分合成著色劑存在一定安全隱患，某些食品飲料生產(chǎn)企業(yè)為了自身的利益，可能會(huì)超限量使用和非法添加合成著色劑[2-3]。如果長(zhǎng)期大量食用這些超限量或非法添加合成著色劑的食品，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害。例如會(huì)引起生育能力下降，損傷兒童智力發(fā)育，也可能會(huì)對(duì)人體肝臟產(chǎn)生一定程度的危害，部分著色劑在人體內(nèi)可能轉(zhuǎn)換成致癌物質(zhì)[4-6]。因此，對(duì)于合成著色劑的使用范圍及使用量，在我國(guó)都有明確的規(guī)定。目前，水溶性著色劑檢測(cè)的前處理方法主要有固相萃取法、聚酰胺粉吸附法、QuEChERS法和溶劑超聲提取法等[7-11]。定量檢測(cè)方法主要有紫外可見分光光度法、高效液相色譜法、薄層色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[12-13]。本研究擬利用超聲、離心、固相萃取、氮吹等前處理方法進(jìn)行飲料中12種水溶性合成著色劑的提取和凈化和濃縮，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性和定量分析，本方法可以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確篩選飲料中的12種水溶性著色劑，提高檢測(cè)效率，為飲料中合成著色劑的含量檢測(cè)提供研究依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PTFE針式濾器：0.22 μm，上海安譜公司；PWAX小柱：150 mg/6 mL，天津博納艾杰爾公司；Waters ACQUⅠTY UPLC BEH C18色 譜 柱：50 mm×2.1 mm×1.7 μm，Waters公司；甲醇、乙腈、乙酸銨：色譜純，ThermoFisher公司；氨水、甲酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)；檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)和酸性橙：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，曼哈格公司；誘惑紅、偶氮玉紅、酸性紅73：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Dr.Ehrenstorfer公司；飲料樣品：市售，上海地區(qū)市場(chǎng)采購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

ExionLCTM-Sciex Triple Quad 6500液相色譜串質(zhì)譜儀，美國(guó)Sciex公司；Mettler Toledo ME204E型分析天平，梅特勒公司；MilliPore 24UV型超純水儀，美國(guó)MilliPore公司；KQ-500VDE型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器公司；TGL-20M型低溫冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器公司；EFAA-DC24-RT型氮吹儀、SBEQ-CG1824型固相萃取裝置，上海安譜公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

用水配制成濃度為10 mg·L-1的12種水溶性合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，用空白質(zhì)基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋成 50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和1 000 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，混勻，過 0.22 μm PTFE針式濾器，待測(cè)。

1.3.2 前處理方法

（1）不含蛋白質(zhì)液體飲料。取25.0 g樣品至50 mL塑料離心管中，超聲10 min，以4 000 r·min-1冷凍離心5 min，上清液用0.22 μm的PTFE濾膜過濾至進(jìn)樣小瓶中，待上機(jī)分析。

（2）含蛋白質(zhì)液體飲料和固體飲料。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品至15 mL塑料離心管中，加5 mL超純水，渦旋混勻，再超聲10 min，然后以4 000 r·min-1冷凍離心5 min，用一次性吸管將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一15 mL塑料離心管中，重復(fù)用水提取一遍，合并提取液。先后用5 mL甲醇和5 mL超純水活化PWAX小柱，將提取溶液上樣至小柱，棄去流出液。依次用5 mL甲醇和5 mL水淋洗小柱，吹干小柱，接著先用6 mL甲酸甲醇（V/V=1∶50）洗脫，再用6 mL氨水甲醇（V/V=1∶9）洗脫，收集洗脫液至氮吹管中，將氮吹儀的水浴溫度設(shè)定為60 ℃，并將試液氮?dú)獯抵两?，用超純水定容?.0 mL，渦旋均勻后，試液用0.22 μm PTFE針式濾器過濾至進(jìn)樣小瓶，待上機(jī)分析。

1.3.3 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Waters ACQUⅠTY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相 A：5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.4 mL·min-1；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜條件。離子源類型：電噴霧離子源；離子源溫度：550 ℃；掃描方式：負(fù)離子掃描；電噴霧電壓：-4 500 V；干燥氣1：60 psi、干燥氣2：60 psi；離子對(duì)、碰撞電壓等參數(shù)見表2。

表2 12種水溶性合成著色劑采集參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 色素的定性與定量

在食品添加劑檢測(cè)領(lǐng)域，高效液相色譜法應(yīng)用比較廣泛，但在多種水溶性合成著色劑同時(shí)測(cè)定時(shí)，其定性和定量容易受雜質(zhì)干擾，尤其在含量較低時(shí)，定性和定量容易出現(xiàn)偏差。隨著食品檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)可以彌補(bǔ)高效液相色譜方面的缺陷，得到廣泛使用，所以本方法在12種水溶性合成著色劑的定性和定量檢測(cè)時(shí)，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)后，各化合物的響應(yīng)見圖1。

2.2 前處理方法的影響

對(duì)于不含蛋白質(zhì)類液體飲料，其基質(zhì)比較簡(jiǎn)單，且容易混勻，可以直接取適量樣品進(jìn)行超聲處理，微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣檢測(cè)。對(duì)于含蛋白質(zhì)類液體飲料和固體飲料，由于其基質(zhì)比較復(fù)雜，必須采取相應(yīng)的前處理來減少基質(zhì)的干擾，針對(duì)此類樣品，本方法先用水提取色素，然后用PWAX小柱凈化，水浴氮吹濃縮，微孔濾膜過濾后再進(jìn)樣檢測(cè)。

2.3 檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照本方法的前處理和儀器條件，將不含色素的乳飲料作為加標(biāo)基質(zhì)，各進(jìn)樣7次，以3倍信噪比（S/N）作為檢出限。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)曲線，線性相關(guān)系數(shù)r2為0.991～0.999，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）中校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)不低于0.99的要求，最后確定本方法飲料中12種水溶性色素的檢出限為0.01～0.03 mg·kg-1，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35—2016）中的檢出限為0.2～0.5 mg·kg-1的要求。

2.4 回收率和精密度

按照本方法的前處理和儀器條件，將不含色素的碳酸飲料和乳飲料作為加標(biāo)基質(zhì)，選擇線性范圍的低、中、高3個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6次，分別計(jì)算其回收率和精密度。由于尼龍等濾膜材質(zhì)對(duì)于色素會(huì)有一定的吸附，導(dǎo)致回收率降低，本方法采用PTFE材質(zhì)濾膜，可有效降低色素的吸附，有利于回收率的提高。按照本方法進(jìn)行加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)，碳酸飲料中加標(biāo)的12種水溶性色素的回收率為70.9%～108.6%，精密度為1.6%～10.0%，乳飲料中加標(biāo)的12種水溶性色素的回收率為70.6%～102.8%，精密度為0.8%～9.8%。符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）中回收率與精密度的要求，其具體方法驗(yàn)證技術(shù)指標(biāo)見表3。

表3 飲料中12種水溶性色素方法驗(yàn)證技術(shù)指標(biāo)表

2.5 實(shí)際樣品分析

從市場(chǎng)上隨機(jī)采購(gòu)20種不同的飲料，按照本方法對(duì)其進(jìn)行12種水溶性色素含量的檢測(cè)，其中6種飲料檢出了12種水溶性色素，含有一種或幾種色素，如日落黃、亮藍(lán)、檸檬黃、莧菜紅、誘惑紅和胭脂紅等，其含量在0.02～16.50 mg·kg-1，符合我國(guó)規(guī)定的使用范圍和限量要求，20個(gè)樣品著色劑檢出情況見表4。

3 結(jié)論

本研究建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定飲料中12種水溶性合成著色劑的檢測(cè)方法。本方法準(zhǔn)確、快速，針對(duì)基質(zhì)的復(fù)雜程度選擇不同的前處理方法，對(duì)于復(fù)雜樣品能有效減少基質(zhì)干擾，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，能更加準(zhǔn)確快速地定性與定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法在檢出限、回收率、精密度等方面都能滿足飲料中12種水溶性色素的同時(shí)測(cè)定，為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員及技術(shù)研究人員提供了相應(yīng)的技術(shù)參考，對(duì)于食品安全監(jiān)測(cè)也具有重要的意義。