陳弘林 沈耿楊 尚奇 秦威城 余富勇 招文華 張志達 張鵬 唐福宇 江曉兵 任輝*

1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006 3.廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心，廣東 廣州 510405 4.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001

破骨細胞是一種組織特異性的巨噬細胞多核體，由骨表面或骨表面附近的單核/巨噬細胞前體細胞分化而成[1]。成熟的破骨細胞粘附于骨基質(zhì)，分泌酸和溶解酶，降解骨基質(zhì)[2]。在生命中，骨骼是一個堅硬但充滿活力的器官，它不斷地被塑造和修復。骨一旦形成，就會經(jīng)歷一個稱為重塑的過程，包括骨的分解(吸收)和形成(合成)。骨重塑是成人生活中調(diào)節(jié)骨結(jié)構(gòu)和功能的主要代謝過程，破骨細胞是關(guān)鍵參與者。重塑的不平衡會導致骨骼結(jié)構(gòu)和功能的嚴重損害[3-4]。因此，掌握巨噬細胞誘導破骨分化這一過程，就可以控制骨重塑的平衡。

然而，破骨細胞作為一種終末分化細胞，其無法傳代培養(yǎng)、存活時間短、體內(nèi)數(shù)量少等特性使得它的培養(yǎng)效率低下。這一難題極大地限制了骨穩(wěn)態(tài)領域的研究，因此，一種理想良好的破骨細胞誘導方法對骨重塑的研究意義重大。目前破骨細胞的培養(yǎng)方案大多采用骨髓源性巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)進行誘導，但是細胞雜質(zhì)多，增殖速度慢，誘導成功率不高等問題[5]。同時，培養(yǎng)過程中對于BMDM誘導破骨分化的代數(shù)要求并未明確提及，以及是否存在一定的規(guī)律性也未了解。所以，為了便于更好培養(yǎng)破骨細胞進行研究，本研究通過比較BMDM不同代數(shù)之間的增殖及破骨分化情況，研究其中存在的規(guī)律，為接下來科研人員開展破骨細胞相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物選取8周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物實驗經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(編號：TCMF1-2019030)。

1.1.2試劑與耗材α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)；胎牛血清(GIBCO)；Recombinant Mouse TRANCE/TNFSF11/RANK L (462-TEC-010，RD)；Recombinant Mouse M-CSF Protein(416-ML-010，RD)；紅細胞裂解液(Beyotime)；CCK-8 試劑盒(日本同仁)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(Sigma)。70 μm細胞篩(FALCON)；75 cm2培養(yǎng)瓶(CORNING)，培養(yǎng)皿(CORNING)，96孔板(CORNING)。

1.2 方法

1.2.1小鼠BMDM的提取與培養(yǎng)：8周齡C57BL/6雄性小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死后，75 %酒精浸泡5 min后，無菌操作完整分離小鼠雙下肢，快速剝離軟組織，取出股骨與脛骨，剪去長骨兩端，用PBS從兩端交替沖洗骨髓腔，沖洗液經(jīng)70 μm細胞篩過濾后離心(1 500 r/min，5 min)，棄上清；加入適量體積的紅細胞裂解液吹打重懸，于冰上靜置裂解5 min，離心，棄上清；再次PBS重懸，離心，棄上清；得到的細胞沉淀用α-MEM培養(yǎng)基(含10 % 胎牛血清，25 ng/mL MCSF)重懸，接種至75 cm2培養(yǎng)瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，5 % CO2)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)基每兩天更換一次[6]。

1.2.2BMDM傳代和分組：BMDM細胞貼壁后為梭形，簇狀分布，長滿瓶底80 %時，使用胰酶消化后傳代，加入含有25 ng/mL M-CSF的完全培養(yǎng)基置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，5 % CO2)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)基每兩天更換一次。根據(jù)傳代次數(shù)，研究分組為P0組、P1組、P2組、P3組及P4組，倒置顯微鏡鏡下進行觀察并拍照。

1.2.3CCK8檢測細胞增殖活性：P0組、P1組、P2組、P3組及P4組細胞以2×103個/孔的密度接種于96 孔板中，每組6個復孔，待細胞貼壁，在含有25 ng/mL M-CSF的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h及96 h后運用CCK-8 法檢測BMDM細胞的增殖能力。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測定BMDM經(jīng)450 nm 波長處的光密度值(optical density，OD)[7]，生物重復3次。

1.2.4體外破骨細胞培養(yǎng)：P0～P4代BMDM以2×103個/孔密度傳代于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，5 % CO2)培養(yǎng)5～7 d，加入25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL，每兩天換液一次。

1.2.5TRAP染色檢測破骨分化：BMDM用上述方法誘導后，鏡下觀察到明顯的多核融合的破骨細胞時行TRAP染色，棄原培養(yǎng)基，使用PBS 洗3遍，每次5 min，加入4 %多聚甲醛進行固定30 min，再次PBS洗3遍，每次5 min，洗時注意輕柔操作。最后加入TRAP 染色工作液，避光37 ℃孵育1 h，PBS 洗2遍，可見孔內(nèi)細胞表面被染成酒紅色，孔板風干后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。TRAP陽性細胞有3個或3個以上的核，即認為是成熟的破骨細胞。使用Image J軟件量化破骨細胞的數(shù)量和面積。生物重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。所有樣本均符合正態(tài)分布，并驗證了方差齊性。兩個獨立樣本的比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對多組單因素樣本進行比較。采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)比較雙變量多樣本組。當P< 0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 P0～P4代BMDM的形態(tài)學差異

從小鼠骨髓分離的BMDM經(jīng)M-CSF培養(yǎng)后，對不同代數(shù)的BMDM進行倒置顯微鏡下拍照。結(jié)果顯示，P0代見多種細胞并存，成纖維細胞或其他雜質(zhì)細胞較多；其中可見BMDM貼壁，細胞透亮，呈小圓形或橢圓形，細胞膜邊界完整清晰，形態(tài)有一定的規(guī)整性。P1代可見雜質(zhì)細胞減少，能明顯觀察到部分BMDM呈橢圓形伴一端或兩端有觸角伸出。P2代見BMDM兩端觸角較P1明顯伸長，細胞整體呈梭形，細胞大小基本一致，形態(tài)均一，密度較高，且呈典型集落分布，基本無雜質(zhì)細胞。P3代可見BMDM呈長梭形，集落分布，少量BMDM有多個偽足伸出。P4代見細胞狹長，多個BMDM偽足增多，較P3代偽足明顯變長(見圖1)。

注：骨髓源性巨噬細胞不同代數(shù)鏡下拍照，黃色箭頭為成纖維細胞或其他雜質(zhì)細胞，綠色箭頭為衰老的BMDM。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對多組單因素樣本進行比較。圖1 P0～P4代BMDM的形態(tài)學差異Fig.1 Morphological differences of P0-P4 generation BMDMs

2.2 P0～P4代BMDM增殖能力差異

通過比較CCK8實驗中P0～P4代BMDM在0、24、48、72 h及96 h5個不同時間點在450 nm 波長處的OD值，從而對比P0～P4代BMDM間的增殖活性差異。結(jié)果顯示，在0、24 h和48h3個時間點上，P0～P4代BMDM間的增殖能力部分存在差異；在72 h和96 h這兩個時間點上，P2組BMDM的增殖能力顯著高于其他組(P< 0.000 1，圖2 A)?？梢娂毎囵B(yǎng)24 h時P2組BMDM的增殖能力高于P4組(P< 0.001，圖2 A)；48 h 時P1～P4組BMDM的增殖能力均顯著高于P0組(P< 0.000 1，圖2 A)，P3組BMDM的增殖能力高于P4組(P< 0.05，圖2 A)。依據(jù)OD值，繪制細胞在不同時間點的增殖曲線(圖2 B)，可直觀的發(fā)現(xiàn)0、24、48、72、96 h內(nèi)，P2組BMDM增殖能力最強，P3組次之，P0組、P1組最差，見圖2。

注：采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)比較雙變量多樣本組；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001，****P< 0.0001。圖2 P0～P4代BMDM增殖能力差異Fig.2 Differences in the proliferation ability of BMDMs of P0-P4 generations

2.3 P0～P4代BMDM誘導破骨分化形態(tài)差異

P0-P4代BMDM通過M-CSF和RANKL誘導破骨分化，培養(yǎng)5～7 d后進行TRAP染色比較P0～P4間誘導破骨分化的形態(tài)不同。結(jié)果顯示，P0～P4代的破骨細胞數(shù)量和面積呈先增后減的趨勢，其中P2代BMDM誘導破骨分化獲得成熟的破骨細胞數(shù)量最多、面積最大；P3組次之；P0組、P1組、P4組誘導出破骨細胞數(shù)量少，面積小。見圖3。

注：兩個獨立樣本的比較采用兩獨立樣本t檢驗。圖3 P0-P4代BMDM誘導破骨分化潛能差異Fig.3 Differences in the osteoclast differentiation potential of P0-P4 generation BMDM

3 討論

你走的每一步都會對你的骨骼造成微小的損傷，因此你的骨骼必須不斷重塑以保持其強度。這種重塑涉及到骨的破壞和形成，這兩個過程緊密耦合，并由信號分子(如激素)控制[8-9]。缺乏這些分子中的一種就會導致骨骼迅速破裂，就像絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素丟失時所發(fā)生的那樣，由此產(chǎn)生的骨質(zhì)疏松癥每年都會造成數(shù)百萬例骨折。目前的骨質(zhì)疏松治療不能將骨降解和骨形成分離開來，它們同時刺激或抑制這兩個過程，盡管強度不同。在骨折愈合的過程中，成骨細胞合成骨基質(zhì)以固定骨碎片，而破骨細胞在骨折后不久吸收小的骨碎片，在愈合的后期吸收未成熟的骨基質(zhì)[10-12]。破骨分化作為骨穩(wěn)態(tài)相關(guān)疾病治療的關(guān)鍵調(diào)控點，有助于闡明骨微環(huán)境中骨形成的機制。

破骨細胞誘導生成實驗是在體外分離和培養(yǎng)破骨細胞的最廣泛的方法。M-CSF和RANKL不僅是體外誘導巨噬細胞完成破骨分化的必要因子，而且這兩種因子的濃度極大地影響了破骨細胞在體外培養(yǎng)的效率，包括巨噬細胞的增殖，破骨細胞的個數(shù)、面積和骨吸收能力。目前體外培養(yǎng)主要通過誘導RAW 264.7細胞或BMDM獲得破骨細胞。RAW 264.7突破破骨細胞前體存活時間短的限制，只需要低濃度的RANKL刺激因子就可以完成誘導穩(wěn)定獲取破骨細胞[13-15]，從而受到相當數(shù)量研究者的青睞。相比較而言，BMDM誘導法操作過程復雜，需要MCSF和RANKL同時刺激才能誘導破骨分化，其形成的破骨細胞數(shù)量少于RAW264.7細胞誘導法，BMDM誘導法需要大量的小鼠才能獲得較充足的BMDMs。相對于RAW264.7而言，BMDM的提取復雜，增殖速度慢，誘導時間長，需要誘導因子濃度高，因此如果要進行后期的Western Blot和qPCR等實驗，使用該方法時間成本與經(jīng)濟成本均較高。而RAW264.7 細胞可以傳代和凍存，增殖速度快，誘導形成的破骨細胞數(shù)量多[16]，即使是進行后續(xù)的分子生物學研究也有足夠數(shù)量的細胞進行實驗，長遠來看成本要低于BMDM誘導法。盡管如此，BMDM誘導法同樣具有其優(yōu)勢。首先，BMDM來源于小鼠骨髓，細胞攜帶有遺傳信息，體現(xiàn)母體的基因型，在模式動物的研究中無可替代[17-18]；其次，使用BMDM的研究更貼近實際情況，能夠更好的模擬生物體內(nèi)細胞的生長和分化情況[19]。尤其是針對模式動物的骨穩(wěn)態(tài)研究，BMDMs的提取、誘導及干預不可避免。從小鼠的骨髓腔中獲取巨噬細胞進而誘導培養(yǎng)形成破骨細胞的方式與體內(nèi)破骨細胞的生存條件類似，因此研究得出的結(jié)論能夠更好模擬骨微環(huán)境，可信度高，意義更大。

本研究采用基于M-CSF和RANKL的誘導破骨細胞分化方法，使用C57BL/6小鼠的骨髓來源巨噬細胞進行培養(yǎng)。BMDM分離出來后，立即進行細胞種植與分化。M-CSF能促進單核細胞向破骨細胞前體細胞分化，刺激破骨細胞前體細胞表達RANK并與RANKL結(jié)合[8]，使前體細胞融合為多核的成熟破骨細胞[1,18-21]。鑒于目前沒有研究涉及BMDM傳代的代數(shù)不同對其增殖及破骨分化的影響，故本研究通過形態(tài)學分析，CCK8檢測及TRAP染色等實驗對P0～P4代BMDM的形態(tài)，增殖能力及破骨分化能力進行對比分析。通過形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)P0～P4代BMDM的細胞純度逐漸增加，且形態(tài)逐漸發(fā)生變化，由小圓形或橢圓形→兩端有觸角伸出→長梭形→偽足伸出；同時，CCK8檢測發(fā)現(xiàn)P0～P4代BMDM中P2代BMDM對比其余代數(shù)具有更強的增殖能力。為進一步檢驗P0～P4代BMDM的破骨分化能力是否存在差異，使用等濃度的M-CSF和RANKL誘導P0～P4代BMDM完成破骨分化，并進行TRAP染色實驗。結(jié)果顯示，P0～P4代BMDM均能發(fā)生破骨分化，其中P2代可誘導出的破骨細胞數(shù)量最多、面積最大。

綜合以上論述及研究數(shù)據(jù)可得，P2組BMDM相較于其他4組純度最高，增殖能力最強，破骨分化潛能最大。本研究為日后科研人員對BMDM的培養(yǎng)及誘導破骨分化的代數(shù)選擇方面提供實驗依據(jù)，基于基因編輯動物的原代細胞研究也會因此受益。