◎ 陳 菲，武若飛，薩日娜，姚英杰，許 晶

（東北農業(yè)大學 文理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）作為一種重要的植物蛋白產品，主要由大豆球蛋白（11S，52%）和β-伴大豆球蛋白（7S，35%）組成，其蛋白質含量高達90%以上，具備乳化性、溶解性和發(fā)泡性等功能特性[1-2]。這些良好的功能特性使大豆蛋白在食品方面有著廣泛的應用，如應用于烘焙食品、面制食品等食品產業(yè)[2]。相關研究表明，當溶液pH值與大豆蛋白等電點（pH=4.5）相近時，蛋白質會因為表面所帶電荷較少以及疏水相互作用增強的影響，以聚集體的形式存在，此時蛋白質的溶解性較差，這限制了其在一些偏酸性食品（如乳制品飲料）中的應用[3-4]。除此之外，天然蛋白容易腐敗，滋生多種微生物，不易保存，為延長蛋白類食品的保質期，往往需要向其中添加一定量的化學防腐劑，而食品配方中含有化學防腐劑可能會給產品認可度帶來消極影響。

近年來，一些研究學者利用化學改性技術，試圖改善蛋白質在酸性條件下的功能性質。有研究發(fā)現，酯化改性不僅可以改善蛋白質在酸性條件下的溶解度，還可以使蛋白質表面攜帶正電荷[5]。當酯化蛋白表面攜帶的正電荷與細菌表面的負電荷成分進行相互作用時，可以使細胞膜表面被撕裂或形成孔洞，導致細胞內溶物泄露、細菌凋亡，從而對細菌的生長、繁殖起到抑制作用。因此，酯化蛋白既有在酸性條件下生產乳類食品的潛能，又能夠作為天然防腐劑抑制有害微生物的生長繁殖。然而，現階段將酯化改性蛋白應用于酸性食品的研究較少?；谏鲜霰尘?，本文分別以SPI、11S和7S 3種大豆蛋白質為原料，制備酯化大豆蛋白MSPI、M11S和M7S，研究酸性條件下酯化大豆蛋白對微生物的抑制作用，為大豆蛋白在酸性食品中得到更廣泛的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與菌種

低溫脫脂大豆粕粉從山東招遠食品有限公司購買。大腸桿菌（E. coli，革蘭氏陰性菌）、沙門氏菌（Salmonella，革蘭氏陰性菌）以及金黃色葡萄球菌（S. aureus，革蘭氏陽性菌）都來自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 儀器與設備

FT200-SH數顯高速均質分散機（上海標本模型廠）、LYOQUEST-85PLUS凍干機（Telstar儀器公司）、SC-3610型低速離心機（安徽中科中佳科技股份有限公司）、IRTracer-100紅外光譜儀（Shimadzu儀器公司）、Zetasizer Nano Zeta電位分析儀（Malvern儀器公司）、手提式壓力蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）及L-8800氨基酸分析儀（Hitachi儀器公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質的提取

在WANG等[6]的實驗方法上加以修改，按照圖1的流程對SPI進行提取，圖2的流程對11S和7S進行提取，并利用凱氏定氮法確定SPI、11S和7S的蛋白含量分別為91.35%、80.32%、84.65%。

圖1 SPI的提取流程圖

圖2 11S和7S的提取流程圖

1.2.2 氨基酸分析

準確稱取50 mg蛋白質，加入10 mL HCl（6 mol·L-1），用氮氣吹掃15 min，置于烘箱中（110 ℃）水解1 d。取出，待其自然冷卻到室溫，對樣品進行全部過濾，并定容在50 mL容量瓶中。準確移取1 mL樣品，放入真空濃縮儀中濃縮至干，加入1 mL上樣緩沖液，使蛋白質完全溶解。將溶解后的樣品過0.45 μm濾膜，移取500～1 000 μL進行氨基酸分析。

1.2.3 蛋白質的酯化改性

（1）酯化大豆蛋白的制備。在SITOHY等[5]的實驗方法上加以修改，將濃甲醇（＞99.5%）、鹽酸和無水乙醇低溫冷藏，4 ℃下按2%～7%（W/V）的物料比將蛋白樣品加到濃甲醇中。反應開始時，逐滴加入12 mol·L-1的鹽酸至最終濃度分別為0.7 mol·L-1、1.5 mol·L-1、3.0 mol·L-1，4 ℃下連續(xù)攪拌 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h，抽濾得到固體產品。用等體積無水乙醇清洗，重復操作3次去除殘余鹽酸和甲醇，并用超純水溶解沉淀物，使酯化蛋白固體在水中分散，4 ℃下透析3 d，凍干，得到3種酯化大豆蛋白（MSPI、M11S、M7S），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）酯化率的測定。依據CHANG等[7]的實驗方法，準確移取0.25 mL樣品溶液（5 mg·mL-1）與0.15 mL的EDTA（0.05 mol·L-1）混合，渦旋的同時加入0.25 mL的鹽酸羥胺（1 mol·L-1），再加入0.1 mL NaOH（6 mol·L-1），渦旋 1 min；在 75 ℃下水浴加熱5 min，取出，自然冷卻至室溫，加入0.8 mL HCl（1 mol·L-1），再次渦旋1 min；離心，取上清液，并向上清液中加入80 μL FeCl3·6H2O溶液（5%W/V），在475 nm處測定吸光度。

通過乙酸乙酯標準曲線得出酯化蛋白含有的酯基摩爾數，根據酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）含量計算蛋白質中游離羧基的總含量[5]。結果表明，每克SPI、11S和7S中羧基的摩爾數分別為1.048 mmol、1.334 mmol和1.244 mmol。最后，按照下式計算蛋白質的酯化率：

式中：M1為酯化蛋白含有的酯基摩爾數；M2為天然蛋白含有的游離羧基總摩爾數。

1.2.4 紅外光譜測定

參考SUN等[8]研究方法，將樣品與溴化鉀按照質量比1∶100混合均勻，壓成固體制片。使用FT-IR光譜儀，調節(jié)儀器參數分辨率為4 cm-1，設定波數范圍為400～4 000 cm-1，進行紅外光譜測定，掃描64次。

1.2.5 Zeta-電位測定

參考LI等[9]的研究方法并稍作修改，使用Zeta電位分析儀測定樣品的Zeta-電位。測量之前先用10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=5.0～9.0）將樣品進行稀釋，避免多重光散射效應。

1.2.6 抑菌性分析

實驗中所用到的試劑和器材均事先進行高壓蒸汽滅菌再冷卻至室溫，備用。依據SITOHY等[5]研究方法并稍做修改，移取20 mL滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于玻璃平皿中，自然冷卻，待凝固后備用。用無菌生理鹽水將1 mL含108～109CFU·mL-1細菌（革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋至106CFU·mL-1，制成菌懸液。移取100 μL菌懸液，將其均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，輕輕放置牛津杯，并向杯中加入150 μL樣品。為消除緩沖溶液對實驗結果的影響，使用只含有天然SPI、11S和7S的相同緩沖液作為對照組[10]。將所有的培養(yǎng)皿放在4 ℃環(huán)境中靜置12 h后取出，恢復至室溫。最后，將其置于（36±1）℃條件下，靜置培養(yǎng)1 d，并準確測量抑菌圈大小。

1.3 數據分析

所有實驗均平行進行3次，并將實驗結果書寫成“平均值±標準差”的形式。使用SPSS V20.0軟件處理數據，進行ANOVA差異顯著性分析（p＜0.05為差異顯著）；采用Origin Version 8.1軟件進行圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 酯化蛋白制備條件的確定

2.1.1 反應時間對酯化率的影響

由圖3可知，不同蛋白質在相同反應時間內酯化率不同，SPI酯化率最高，11S和7S酯化率略低；但是，當不斷延長反應時間時，這3種蛋白質的酯化率均先逐漸升高后趨于穩(wěn)定。SPI酯化率由2 h時的（24.7±3.1）% 增加到10 h時 的（51.4±0.4）%后不再明顯增加；與SPI相似，11S酯化率由2 h時的（20.8±0.8）%增加到10 h時的（42.1±0.2）%后不再明顯增加；7S酯化率由2 h時的（18.3±1.8）%增加到8 h時的（36.9±0.2）%后不再明顯增加。故這3種大豆蛋白與甲醇充分反應后，繼續(xù)延長反應時間并不能提高蛋白質的酯化率。這主要是因為蛋白質中可以參與酯化反應的游離羧基數是有限的，無限延長反應時間對提高酯化程度無較大意義。因此，制備MSPI、M11S、M7S較為合適的反應時間分別為10 h、10 h、8 h。

圖3 反應時間對蛋白質酯化率的影響圖

2.1.2 鹽酸濃度對酯化率的影響

如圖4所示，當鹽酸濃度從0.7 mol·L-1增加到3 mol·L-1時，SPI、11S和 7S 3種蛋白質的酯化率均先上升后下降，且這3種蛋白質的最高酯化率所對應的鹽酸濃度均為1.5 mol·L-1。本實驗結果與SITOHY等[5]使用的酯化蛋白制備條件相同。反應開始隨著鹽酸濃度的增加，蛋白質的酯化率顯著增加，說明鹽酸促進了羧基質子化，使蛋白質的酯化程度得到提高。當鹽酸濃度達到3.0 mol·L-1時，發(fā)現蛋白質-甲醇-鹽酸混合體系由微黃色混濁液變成粉紅色，說明鹽酸濃度過高，破壞了蛋白質的結構，體系發(fā)生了副反應，對羧基反應產生了不利的影響。WANG等[11]的研究結果也發(fā)現類似現象。因此，制備MSPI、M11S、M7S較為合適的鹽酸濃度為1.5 mol·L-1。

圖4 鹽酸濃度對蛋白質酯化率的影響圖

2.1.3 物料比對酯化率的影響

如圖5所示，當蛋白質與甲醇的物料比為2%～5%時，SPI、11S和7S的酯化率無明顯變化；但是當蛋白質與甲醇的物料比超過5%時，3種蛋白質的酯化率均有所降低。此結果表明，當物料比為2%～5%時，鹽酸已將蛋白質的羧基充分質子化，蛋白質最大程度與甲醇反應生成酯鍵；繼續(xù)增加蛋白質含量，可能會導致部分蛋白質的羧基沒有發(fā)生質子化，未參與反應的游離羧基含量升高，最終蛋白質的酯化率下降。結合酯化蛋白產率的需求，物料比5%時可以制備更多的酯化蛋白，故制備MSPI、M11S、M7S較合適的蛋白質與甲醇物料比為5%（W/V）。

圖5 物料比對蛋白質酯化率的影響圖

綜上，SPI和11S酯化改性的最佳條件為反應時間10 h、鹽酸濃度1.5 mol·L-1、蛋白質與甲醇物料比5%（W/V）；7S酯化改性的最佳條件為反應時間8 h、鹽酸濃度1.5 mol·L-1、蛋白質與甲醇物料比5%（W/V）。

2.2 紅外光譜分析

如圖6所示，所有蛋白樣品在3 300 cm-1附近的明顯寬峰是O-H和N-H的伸縮振動引起的；而2 960 cm-1附近的峰是CH2和CH3上的C-H拉伸振動引起的；1 630～1 670 cm-1附近的峰是C=O的伸縮振動（酰胺I帶）引起的[12]；1 520～1 540 cm-1附近的峰是N-H鍵的變形振動和C-N的拉伸振動（酰胺II帶）引起的[13-14]。對蛋白質進行酯化改性后，蛋白質上的羧基與甲醇的羥基進行反應會生成酯基。樣品MSPI，M11S和M7S的酯基在1 750～1 730 cm-1和1 300～1 000 cm-1處有2個較強吸收帶，分別代表C=O和C-O的拉伸振動[11]。比較天然蛋白和酯化蛋白的紅外光圖譜，發(fā)現所有酯化蛋白在1 733 cm-1處均出現C=O吸收帶，而天然蛋白在此處無吸收帶，表明對天然蛋白進行酯化改性成功，生成了酯化蛋白，類似的實驗結果在WANG等[11]、MORAND等[15]、SALINAS等[16]的研究中也被報道。

圖6 酯化蛋白的紅外光譜圖

2.3 酯化蛋白等電點（pI）分析

如圖7所示，M11S在pH=9.0時的電位為零，說明M11S的等電點（pI）為pH=9.0；同理，MSPI和M7S的pI值分別為pH=10.3和pH=10.4；天然SPI、11S和 7S的 pI值 分 別 為 pH=4.5、pH=6.4和pH=4.8[1,3]，兩者相比，酯化蛋白的等電點顯著升高，且酯化改性后3種蛋白質的pI值大小順序為M7S≈MSPI＞M11S。根據SITOHY等[5]觀點，酯化蛋白比天然蛋白的等電點高，很可能是酯化改性封閉了蛋白質的游離羧基，使酯化蛋白與天然蛋白表面的電荷分布情況不同所致。由于11S蛋白結構致密，酯化程度略低，導致其等電點增幅低于M7S和MSPI，這與蛋白質的酯化率結果一致。

圖7 不同pH時酯化蛋白溶液的Zeta-電位圖

2.4 酯化蛋白抑菌性分析

實驗結果顯示，在pH=5.0的環(huán)境中，對照組對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌沒有抑制效果；然而，在此pH下，酯化大豆蛋白對這兩類細菌存在一定的抑菌性。如圖8所示，隨著酯化蛋白濃度不斷增加，MSPI、M11S、M7S對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制效果均逐漸增強。當3種酯化蛋白濃度均為10 mg·mL-1時，MSPI、M11S、M7S對大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為（11.20±0.02）mm、（10.42±0.07）mm和（11.31±0.2）mm；對沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為（11.34±0.02）mm、（11.47±0.12）mm 和（11.90±0.22）mm；對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（11.33±0.06）mm、（11.25±0.02）mm和（11.27±0.14）mm。而MSPI和M7S濃度為0.1 mg·mL-1時，就可以觀察到抑菌圈；M11S則在1.0 mg·mL-1時，才可以觀察到抑菌圈的出現。因此，MSPI、M11S、M7S出現抑菌效果的最小濃度分別為0.1 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1。

圖8 酯化蛋白的抑菌性圖

3 結論

酯化改性有利于提高SPI、11S、7S的等電點，改善蛋白質在酸性條件下的溶解度；同時，能夠使蛋白質表面攜帶正電荷，通過靜電作用來抑制微生物生長。本實驗以蛋白質酯化率為指標，確定了制備MSPI和M11S兩種蛋白質的最優(yōu)條件：反應時間控制為10 h，鹽酸濃度為1.5 mol·L-1，蛋白質與甲醇物料比為5%（W/V）；制備M7S的最優(yōu)條件：反應時間控制為8 h，鹽酸濃度為1.5 mol·L-1，蛋白質與甲醇物料比為5%（W/V）。在pH=5.0時，MSPI、M11S、M7S具有優(yōu)良的抑菌效果，最小抑菌濃度分別為 0.1·mL-1、1.0·mL-1、0.1 mg·mL-1。本研究制備的酯化大豆蛋白等電點升高，改善了酸性條件大豆蛋白的溶解性，賦予了大豆蛋白抑菌性能，拓寬了大豆蛋白的應用范圍，提高了大豆制品的附加值。