吳偉東， 馬詩淳， 陳 銳， 周廣平， 鄧 宇

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源開發(fā)與利用重點實驗室， 四川 成都 610041)

國家統(tǒng)計局統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年我國生豬、肉牛、羊和家禽的出欄量分別為52704萬頭、4565萬頭、31941萬頭和155.7億只。若依據(jù)《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》(國辦發(fā)〔2012〕31號)中提出的疫病防治目標(生豬、牛、羊、家禽發(fā)病率分別下降到5%、4%、3%、6%以下)核算，我國年病死牲畜和家禽數(shù)量高達3776萬頭和9.3億只。病死畜禽基數(shù)龐大，處理不當可能對生態(tài)環(huán)境和公共衛(wèi)生安全帶來巨大的負面影響，危害人類與動物的生命健康[1]。目前，國內(nèi)外處理畜禽尸體常用的有深埋、焚燒、化制、堿水解以及生物降解等多種較為成熟的無害化處理方法。其中的生物降解法則可分為微生物作用的菌解法，如堆肥或微生物菌劑作用，以及生物酶作用的酶解法兩大類。目前生物降解法多采用菌解法，主要結(jié)合高溫滅菌技術和微生物作用，在病死畜禽無害化處理過程中能徹底殺滅病原體，且操作簡單，運行成本低，是一種更為環(huán)保、經(jīng)濟的病死畜禽無害化處理技術，但卻依舊存在處理過程長、蛋白質(zhì)等資源回收不充分等問題[2-3]。而在生物酶的作用下，畜禽尸體可以達到更快的降解速度，處理過程耗時更短，并且生物酶解反應條件溫和、蛋白質(zhì)資源回收率更高。因而對于病死畜禽的無害化處理和資源回收，生物酶解法相比菌解法可能具有更大的應用價值與開發(fā)潛力。

目前，生物酶解動物蛋白技術的研究多集中于如蛤蜊[4]、龜類[5-6]、海參[7]以及魚蝦[8-9]等水產(chǎn)行業(yè)，畜禽尸體生物酶解技術的研究較少。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶與復合蛋白酶等多種生物酶被證實可以在較短時間內(nèi)水解牛羊肉動物蛋白，產(chǎn)生多種氨基酸和生物活性肽[10-11]。如以單酶、多酶酶解牛肉，酶解產(chǎn)物在保留了牛肉中大部分氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的同時，還鑒定出具有抗氧化、降血壓或抗菌作用的多種生物活性肽，展現(xiàn)出畜禽酶解產(chǎn)物在食品、醫(yī)藥等領域的廣闊應用前景[12]。但是，相比于國內(nèi)龐大的生豬養(yǎng)殖規(guī)模，豬肉生物酶解技術的研究卻仍留有很大的空白。

本研究擬通過探究厭氧角蛋白降解菌KD-1粗酶液和不同商業(yè)化蛋白酶酶解生豬肉的特性及酶解效率，分析主要酶解產(chǎn)物產(chǎn)量及生產(chǎn)成本的差異，評價不同蛋白酶酶解回收畜禽尸體的優(yōu)劣勢，以期為病死畜禽生物酶解技術的研究改進提供理論支持，對于推動病死畜禽的生物酶法處理具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜熱厭氧桿菌(Keratinibaculumparaultunense)KD-1(CCAM 72)由中國厭氧微生物保藏中心(CCAM)保藏并提供。

1.1.2 實驗材料

雞毛購于四川廣漢市正旺蛋白粉廠，自來水清洗后曬干備用；豬肉購于成都市武侯區(qū)某市場，絞碎混勻后備用；堿性蛋白酶(貨號：S10154-100g)、中性蛋白酶(貨號：S10013-250g)、復合蛋白酶(貨號：S10155-100g)以及木瓜蛋白酶(貨號：S10011-100g)，購自上海源葉生物科技有限公司；酪蛋白粉(貨號：C8200)，購自北京索萊寶科技有限公司。其余化學試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及KD-1粗酶液的制備

培養(yǎng)基成分及配制方法參考黃艷[13]等，種子液培養(yǎng)基以20 g·L-1雞毛作為唯一底物，粗酶液制備發(fā)酵培養(yǎng)基以80 g·L-1豬肉絞肉以及2 g·L-1雞毛作為底物，所有培養(yǎng)基和試劑均采用Hungate厭氧操作技術配制，培養(yǎng)基初始pH值為8.5，121℃滅菌30 min[14]。將菌株KD-1以5%比例接種于種子液培養(yǎng)基中，55℃厭氧恒溫培養(yǎng)24 h。再將種子液以5%比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，55℃厭氧恒溫培養(yǎng)24 h，離心收集發(fā)酵液上清用作粗酶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解實驗設計

取制備好的厭氧角蛋白降解菌KD-1粗酶液以及以無菌水溶解、重懸的各種商業(yè)化蛋白酶酶液，以酪蛋白作為底物，各酶液在最適條件下(見表1)水浴反應1 h，測得KD-1粗酶液與各商業(yè)化蛋白酶酶液的酶活如表2所示。隨后，各組分別將30 mL酶液與30 g生豬肉充分混合，設置實驗組與滅活對照組(對照組酶解前即對酶液121℃處理15 min終止酶反應)，最適反應條件下酶解3 h后121℃處理15 min終止酶反應。

表2 KD-1粗酶液與各商業(yè)化蛋白酶的蛋白酶活性測定結(jié)果

1.2.2 油脂及干物質(zhì)測算

酶解反應結(jié)束后，10000 rpm離心15 min分離體系中固體殘渣、酶解上清液與油脂，稱重記錄酶解反應后油脂重量，并對酶解前后固形物105℃烘干至恒重，計算干物質(zhì)消耗量，計算公式為：

干物質(zhì)消耗量=等量未處理生豬肉(30 g)干物質(zhì)凈重-實驗組酶解后干物質(zhì)凈重

回收油脂的重量以類似方式進行計算。

1.3 測定方法

1.3.1 最適條件下蛋白酶活性的測定

稱取30 mg酪蛋白粉末與800 μL 磷酸緩沖液混勻，加入400 μL稀釋酶液。在各類酶最適溫度，pH值條件下反應 1 h，隨后加入800 μL 10% TCA 終止反應。冰浴10 min，10000 rpm離心10 min，取上清，于可見光280 nm處測定吸光值。對照組在反應前即加入800 μL 10% TCA。蛋白酶活定義：每400 μL酶液反應1 h后，A280每增加0.004為一個酶活單位。

1.3.2 游離總氨基酸(T-AA)含量的測定

依據(jù)總氨基酸(T-AA)測試試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，貨號：A026-1-1)測試方法測定酶解上清液中游離的總氨基酸含量，并將酶解上清液寄送至四川藍城檢測技術有限公司測定游離氨基酸的組成。

1.3.3 可溶性蛋白與多肽蛋白含量的測定

蛋白含量測定參照張雪旺[15]的方法，并將樣品與雙縮脲總蛋白試劑(購自雷根生物，貨號：PT0003-500 mL)的反應體系縮小至2 mL進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物酶酶解豬肉的效率及油脂的回收量

蛋白酶種類的不同往往是影響酶解過程的一個重要因素，不同的蛋白酶酶特異性以及酶切位點各不相同，進而使得KD-1粗酶液與各商業(yè)化蛋白酶表現(xiàn)出對生豬肉酶解能力的不同。采用KD-1粗酶液與各類商業(yè)蛋白酶酶解生豬肉，以30 g生豬肉徹底烘干作為干物質(zhì)總重(9.71 ± 0.21 g)，測得各組干物質(zhì)消耗量如圖1所示。實驗結(jié)果表明，經(jīng)蛋白酶酶解3 h后，在堿性蛋白酶或復合蛋白酶酶液作用下生豬肉干物質(zhì)的消耗量相對較高，分別為7.48 ± 0.18 g與7.43 ± 0.14 g，占總干物質(zhì)量的77.07%與76.55%。KD-1粗酶液消耗干物質(zhì)量約為7.11 ± 0.19 g，占比73.19%；木瓜蛋白酶消耗干物質(zhì)量約為6.70 ± 0.31 g，占比69.04%；中性蛋白酶消耗的生豬肉干物質(zhì)量最低，僅5.79 ± 0.04 g，占比59.66%。堿性蛋白酶酶解干物質(zhì)消耗量最高，這可能是由于堿性蛋白酶作為一種特異性廣泛的內(nèi)切蛋白酶，具有較多的催化位點用于水解肽鍵, 還具有水解酰胺鍵等功能，故而使得酶解反應更加完全[17]。同時，復合蛋白酶表現(xiàn)出了與堿性蛋白酶相近的酶解生豬肉的能力，這可能是因為本試驗選擇的復合蛋白酶包含了微生物來源的枯草桿菌蛋白酶與植物來源的木瓜蛋白酶，其中的枯草桿菌蛋白酶屬于胞外絲氨酸蛋白酶，具有廣泛的底物特異性與較高的蛋白水解活性[18]。而木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶，廣泛應用于多肽的制備，對動植物蛋白同樣具有較強的水解能力[19-20]。中性蛋白酶則主要作用于蛋白質(zhì)肽鏈的中間位點，對疏水性氨基酸表現(xiàn)出特異性[21]。

注：*表示與KD-1粗酶液組比較的顯著性差異分析，*數(shù)量越多表示差異越顯著(下同)。

根據(jù)圖2中回收油脂的重量可知，中性蛋白酶酶解生豬肉僅回收油脂3.03 ± 0.18 g，顯著(p<0.05)低于KD-1粗酶液(4.50 ± 0.26 g)、堿性蛋白酶(4.20 ± 0.12 g)、復合蛋白酶(4.23 ± 0.20 g)與木瓜蛋白酶(4.05 ± 0.44 g)酶解生豬肉回收油脂的重量。結(jié)果表明，在KD-1粗酶液作用下，酶解1 t豬肉可回收油脂149.89 ± 8.56 kg，超過堿性蛋白酶(139.89 ± 3.98 kg)、中性蛋白酶(101.11 ± 6.14 kg)、復合蛋白酶(141.11 ± 6.72 kg)與木瓜蛋白酶(135.11 ± 14.58 kg)作用下的油脂回收量。KD-1粗酶液酶解生豬肉油脂回收量最高，這可能是由于菌株KD-1作為一株羽毛角蛋白高效降解菌，其可以分泌包含高活性角蛋白酶在內(nèi)的多種蛋白酶，研究證實其能在24 h內(nèi)完全降解羽毛角蛋白[22]。故而KD-1粗酶液可能在酶解過程中還表現(xiàn)出了酶解豬肉表皮角蛋白的能力，并且KD-1粗酶液酶解反應溫度更高，二者都有助于豬肉油脂的溶解釋放。

圖2 豬肉酶解后油脂回收重量

結(jié)合干物質(zhì)消耗量以及油脂回收量發(fā)現(xiàn)，在最適條件下酶解3 h，堿性蛋白酶與復合蛋白酶表現(xiàn)出更強的酶解豬肉的能力，而KD-1粗酶液不僅表現(xiàn)出了較高的酶解豬肉的能力，可能還更有利于酶解生豬肉回收油脂。

2.2 生物酶酶解豬肉的特性

結(jié)果顯示生豬肉經(jīng)KD-1粗酶液及各種商業(yè)化蛋白酶酶解后，不同酶作用下生豬肉的酶解產(chǎn)物，如游離氨基酸、可溶性蛋白與氨氮的產(chǎn)量顯著不同。由圖3可知，在單位酶活的酶液作用下，酶解1 g豬肉，復合蛋白酶作用下酶解上清液中的游離氨基酸產(chǎn)量最高，為3.29 ± 0.11 μg·g-1U-1。而后依據(jù)單位產(chǎn)量進行排序，從高到低依次為木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶與中性蛋白酶，以在KD-1粗酶液作用下的產(chǎn)量最低。游離氨基酸產(chǎn)量分別為2.77 ± 0.13 μg·g-1U-1，2.18 ± 0.10 μg·g-1U-1，1.23 ± 0.07 μg·g-1U-1以及1.13 ± 0.06 μg·g-1U-1(見圖3)。基于國家標準測定方法GB/T 18246，測定得到不同蛋白酶酶解生豬肉的酶解液中游離氨基酸的組成如表3所示。經(jīng)過3 h的酶解后，在KD-1粗酶液與各商業(yè)化蛋白酶的酶解液中均檢測到17種氨基酸，并且表現(xiàn)為組氨酸的含量相對較高，均超過了0.20 g·100 g-1酶解液。在這17種氨基酸中，商業(yè)化蛋白酶酶解豬肉產(chǎn)生的亮氨酸含量相對較高，均超過了0.20 g·100 g-1，并以復合蛋白酶酶解液中的含量最高，但在KD-1粗酶液的酶解液中亮氨酸含量僅0.04 g·100 g-1。此外，堿性蛋白酶酶解液中游離氨基酸總量均高于其余各生物酶，且游離氨基酸包括蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸以及組氨酸釋放率均最高。木瓜蛋白酶酶解液中也含有相對較高的谷氨酸含量。同時，由于木瓜蛋白酶的酶解位點為賴氨酸、精氨酸和甘氨酸的氨基端與羧基端[19-20]，其酶解液中甘氨酸、賴氨酸和精氨酸的含量也相對較高。

圖3 單位酶活酶液酶解豬肉游離氨基酸的產(chǎn)量

表3 生豬肉酶解液中游離氨基酸組成分析

類似的，采用雙縮脲法測定酶解上清液中的可溶性蛋白含量，并計算單位酶活的酶液酶解1 g豬肉的可溶性蛋白的產(chǎn)量如圖4所示。在木瓜蛋白酶作用下，酶解1 g豬肉的可溶性蛋白產(chǎn)量高達4.32 ± 0.13 μg·g-1U-1，而KD-1粗酶液與復合蛋白酶作用下的產(chǎn)量則分別為3.59 ± 0.09 μg·g-1U-1與3.62 ± 0.07 μg·g-1U-1，相比堿性蛋白酶與中性蛋白酶更具顯著性優(yōu)勢，后者的產(chǎn)量分別為2.74 ± 0.04 μg·g-1U-1以及1.94 ± 0.14 μg·g-1U-1。

圖4 單位酶活酶液酶解豬肉可溶性蛋白的產(chǎn)量

圖5 單位酶活酶液酶解豬肉氨氮的產(chǎn)量

對比KD-1粗酶液與各商業(yè)化蛋白酶酶解豬肉產(chǎn)物的差異，復合蛋白酶可能更宜用于酶解豬肉制備游離氨基酸，而木瓜蛋白酶則更適用于酶解豬肉以生產(chǎn)可溶性蛋白。但考慮到在KD-1粗酶液作用下略低于木瓜蛋白酶的可溶性蛋白單位酶活產(chǎn)量以及顯著降低的氨氮產(chǎn)量，選擇KD-1粗酶液酶解豬肉可能更有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)過程中，對產(chǎn)物中可溶性蛋白進行回收再利用。

2.3 酶解產(chǎn)物的生產(chǎn)成本分析

而談及對畜禽尸體資源的回收利用，也需對酶解產(chǎn)物的生產(chǎn)成本進行分析，以判斷其是否具有足夠的經(jīng)濟價值。通過計算KD-1粗酶液的生產(chǎn)成本以及酶解過程的能源開支等，在考慮設備折舊以及人工支出的同時，與各商業(yè)化蛋白酶進行比較，結(jié)果顯示，在KD-1粗酶液作用下酶解1 t生豬肉的成本約為2011.82元，這一成本相比堿性蛋白酶(5523.88元)、中性蛋白酶(6543.83元)與木瓜蛋白酶(3552.23元)更低。同時，基于復合蛋白酶高昂的售價，遠低于復合蛋白酶(41223.17元)酶解豬肉的成本。與之對應的是，在KD-1粗酶液或其它商業(yè)化蛋白酶的作用下，酶解1 kg豬肉生成的游離氨基酸、可溶性蛋白以及氨氮產(chǎn)量如表4所示。結(jié)果顯示，復合蛋白酶作用下酶解1 kg豬肉得到的游離氨基酸產(chǎn)量最高，為81.79 ± 4.36 g。而在KD-1粗酶液作用下回收得到的可溶性蛋白更多(101.24 ± 3.20 g)，并且氨氮含量相對較低(1.27 ± 0.03 g)。

表4 酶解1 kg豬肉的酶解產(chǎn)物產(chǎn)量對照表 (g)

而通過計算1 kg酶解產(chǎn)物的生產(chǎn)成本如圖6～圖7所示，在KD-1粗酶液作用下，若僅計算生產(chǎn)單一酶解產(chǎn)物的成本，游離氨基酸的生產(chǎn)成本約為63.40元·kg-1，可溶性蛋白的成本約為19.89元·kg-1，與商業(yè)化蛋白酶酶解產(chǎn)物的生產(chǎn)成本相比，KD-1粗酶液低廉的生產(chǎn)成本，使得其在酶解制備游離氨基酸與可溶性蛋白產(chǎn)物時存在極為顯著的優(yōu)勢。此外，酶解回收的油脂也是病死畜禽處理收益的主要來源之一。通過市場調(diào)研得知，若將從畜禽尸體回收的油脂出售給有資質(zhì)的化制廠或生物柴油廠，受市場波動影響，油脂的售價每t約為1800.00～3000.00元?；趫D2酶解豬肉回收得到的油脂重量結(jié)果，在KD-1粗酶液作用下，酶解1 t豬肉回收得到的油脂還可創(chuàng)造約270～450元的經(jīng)濟收益。

圖6 酶解產(chǎn)物游離氨基酸的生產(chǎn)成本

圖7 酶解產(chǎn)物可溶性蛋白的生產(chǎn)成本

3 結(jié)論

本文就厭氧角蛋白降解菌KD-1粗酶液與多種商業(yè)化蛋白酶酶解生豬肉能力以及酶解產(chǎn)物產(chǎn)量、生產(chǎn)成本進行比較，研究發(fā)現(xiàn)生豬肉經(jīng)不同蛋白酶酶解，生成的酶解產(chǎn)物種類與產(chǎn)量各有不同。針對不同的酶解產(chǎn)物生產(chǎn)需求，復合蛋白酶更適用于游離氨基酸的制備需求，KD-1粗酶液則更適用于可溶性蛋白的制備需求。同時，木瓜蛋白酶也可以提供更高的可溶性蛋白單位產(chǎn)量。但從酶解產(chǎn)物的生產(chǎn)成本進行比較，KD-1粗酶液酶解豬肉生產(chǎn)游離氨基酸與可溶性蛋白的成本都更低，在回收利用畜禽尸體中的蛋白質(zhì)資源技術開發(fā)中具有更好的應用前景與開發(fā)價值。同時，酶解產(chǎn)物中更低的氨氮含量，顯示出酶解產(chǎn)物作為生物有機肥的潛在應用價值。生物酶解病死畜禽制備生物有機肥以替代化肥，在解決病死畜禽尸體資源回收利用問題的同時，還能有效緩解施用化肥對環(huán)境造成的不良影響，具有明顯的經(jīng)濟效益[25-27]。而后續(xù)對厭氧角蛋白降解菌KD-1蛋白酶的進一步研究，或?qū)⒏兄陂_發(fā)病死畜禽尸體蛋白質(zhì)等資源的最大利用價值。