王虹軍，陳芝娟，李曉靜

（1. 杭州博日科技股份有限公司，浙江杭州 310053；2. 鄭州糧食批發(fā)市場(chǎng)有限公司，河南鄭州 450000）

0 引言

嗜酸乳桿菌是重要的益生菌之一，也是人體胃腸道中的重要微生物。大數(shù)據(jù)顯示，益生菌被大量應(yīng)用在食品中尤其是發(fā)酵乳制品中[1]。乳酸菌在發(fā)酵過程中能合成產(chǎn)生多種芳香物質(zhì)和功能性成分，賦予發(fā)酵食品獨(dú)特的風(fēng)味與營養(yǎng)，延長食品的貯藏時(shí)間[2-3]，還具有產(chǎn)生抑菌性代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸、細(xì)菌素、過氧化氫等）、平衡腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)、提高機(jī)體免疫力等諸多有利于機(jī)體的功能[4-5]。劉鑫等人[6]驗(yàn)證嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液可治療多種腸道致病菌及其L 型菌感染引起的腸道疾病。嗜酸乳桿菌還能通過吸收同化膽固醇有效地降低膽固醇的含量[7]。Tajik H 等人[8]分析了與腐敗性細(xì)菌作用產(chǎn)生的有機(jī)致癌物質(zhì)有關(guān)的細(xì)菌酶，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，嗜酸乳桿菌可以通過降低相關(guān)細(xì)菌酶的活性來降低它們向致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)變的可能。乳酸菌發(fā)酵果汁能在原果汁擁有的營養(yǎng)價(jià)值基礎(chǔ)上增添乳酸菌的有益功效，能夠滿足人們對(duì)健康和食品功能性的需求，加上果蔬產(chǎn)量的迅猛加增，乳酸菌發(fā)酵果蔬汁開始流行，發(fā)展前景十分廣闊[9]。

隨著發(fā)酵產(chǎn)品種類和數(shù)量的日益加增，發(fā)酵物料中乳酸菌的定量檢測(cè)已成為產(chǎn)品質(zhì)量與功能評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，食品中乳酸菌檢驗(yàn)方法有平板計(jì)數(shù)法（GB 4789.3—2016 規(guī)定）、流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR 法等，其中熒光定量PCR 技術(shù)因其擁有的高重復(fù)性、高靈敏度、無污染性等優(yōu)點(diǎn)，在食品微生物檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用[10]。依據(jù)嗜酸乳桿菌基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)出的引物及探針，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對(duì)果汁中嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌，中國計(jì)量大學(xué)生命科技學(xué)院食品系提供；嗜酸乳桿菌發(fā)酵果汁；TaKaRa 基因組DNA純化試劑盒，用于提取并純化目標(biāo)細(xì)菌的DNA。

MRS 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，七水合硫酸鎂0.58 g，檸檬酸氫二胺2 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.25 g，酵母浸粉5 g，吐溫- 80 1 mL，加蒸餾水至1 000 mL 調(diào)節(jié)pH 值至6.2~6.4，于立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121 ℃下滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D 單型人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州智華凈化精密儀器有限公司產(chǎn)品；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Lambda 25 型紫外可見分光光度計(jì)，美國Perkin Elmer 公司產(chǎn)品；Kendro D-37520 型高速冷凍離心機(jī)，德國SorvallHeraeus 公司產(chǎn)品；GelX1650 型凝膠成像儀，上海歐翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument（96-well 0.2 mL Block） by Thermo Fisher Scientific。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌含量與OD600線性關(guān)系

以嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的最適條件，在液體MRS 培養(yǎng)基中連續(xù)活化2 次（菌種為保藏于-20 ℃的菌種），第2 次活化15 h 至其生長對(duì)數(shù)期。將這時(shí)的菌液稀釋為不同吸光度（OD600值分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0），相應(yīng)吸光度的菌液再稀釋為適宜的3 個(gè)連續(xù)濃度，分別進(jìn)行平板稀釋涂布，每個(gè)濃度3 個(gè)平行，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h 后，選取有效的平板（菌落數(shù)在30~300 CFU/mL） 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2 模擬樣品及未知樣品核酸提取

（1） 模擬和未知樣品制備。將嗜酸乳桿菌活化后培養(yǎng)至109CFU/mL，以未發(fā)酵果汁為基質(zhì)，進(jìn)行梯度稀釋，分別為109，108，107，106，105，104，103CFU/mL，備用；將馴化成功的嗜酸乳桿菌按3%的量接入調(diào)好糖度、滅過菌的果汁中開始發(fā)酵，發(fā)酵完成后，取一部分進(jìn)行平板稀釋涂布，計(jì)算菌落數(shù)，其余備用。

（2） 核酸提取。樣品混勻，將上述梯度稀釋液和發(fā)酵完成的果汁按基因組DNA 純化試劑盒所配說明進(jìn)行核酸提取（若提取好的DNA 需較長時(shí)間存放則需用Elution Buffer 洗脫，置于-4 ℃或-20 ℃冰箱中，且不能反復(fù)凍融）。

1.3.3 核酸凝膠電泳檢測(cè)核酸

（1） 制膠。0.25 g 瓊脂糖+ 25 mL 1×TAE 微波爐加熱溶解，不燙手時(shí)倒膠。膠成型后，放入電泳槽內(nèi)，往槽內(nèi)加入緩沖液（槽內(nèi)的緩沖液液面需蓋過膠面）。

（2） 進(jìn)樣。15 000 DNA Marker 3 μL，DNA 提取物與溴酚藍(lán)染劑按4 μL+1 μL 體系混勻，用移液槍分別移至凝膠的樣孔中。

接通電泳儀和電泳槽開始跑樣，當(dāng)溴酚藍(lán)的條帶至距膠板前沿約1 cm 處時(shí)，停止電泳，將凝膠從槽中取出放入凝膠成像儀的樣品室中，進(jìn)行分析。

1.3.4 引物、探針設(shè)計(jì)

利用SPIDR 保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)特異性引物、探針，用于嗜酸乳桿菌的鑒定[11]。

1.3.5 熒光定量PCR 的擴(kuò)增體系

Real-Time PCR 總反應(yīng)體系是20 μL，包括Ta-KaRa 探測(cè)儀混合物10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，探針（5 μmol/L） 0.5 μL，DNA 模板2.0 μL，剩余部分以去離子水補(bǔ)齊。設(shè)置Real-Time PCR 反應(yīng)要素為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，35 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.6 模擬樣品檢測(cè)

將藥品按所需加入樣孔板中，其中的模板為梯度稀釋液中提取出的DNA，利用設(shè)置好反應(yīng)條件的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀對(duì)模擬樣品實(shí)施測(cè)定，所有濃度各設(shè)3 個(gè)平行。

1.3.7 未知樣品檢測(cè)

以在發(fā)酵果汁中提取出的DNA 為模板，將所需藥品按各自規(guī)定好的量加入樣孔板中，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀以設(shè)置好的所有參數(shù)對(duì)未知樣品實(shí)施測(cè)定，樣品設(shè)置3 個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌含量與OD600 值標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了實(shí)現(xiàn)模擬樣品所需菌含量的準(zhǔn)確培養(yǎng)，在進(jìn)行模擬樣品制備之前，采用平板計(jì)數(shù)法將不同吸光度所對(duì)應(yīng)的嗜酸乳桿菌的數(shù)量統(tǒng)計(jì)出來，并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

嗜酸乳桿菌含量與OD600值的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由圖1 可知，曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.992 8，所以嗜酸乳桿菌的含量與OD600值之間存在良好的線性關(guān)系，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 嗜酸乳桿菌含量與OD600 值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 核酸電泳結(jié)果

將提取出的DNA 進(jìn)行核酸凝膠電泳，檢測(cè)核酸的提取是否成功。

凝膠成像圖見圖2。

圖2 凝膠成像圖

由圖2 可知，8 樣泳道有明顯條帶，6，8 泳道處條帶微顯，其余樣品孔均無明顯條帶。已知條帶的熒光強(qiáng)度與DNA 含量成正比，因此分析原因?yàn)槠溆鄻悠返暮怂岷勘容^低，所以未出現(xiàn)明顯條帶，但熒光定量PCR 法具有比常規(guī)PCR 法高得多的靈敏度，其絕對(duì)靈敏度可達(dá)到3 pg，所以提取出的核酸可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 模擬樣品檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

模擬樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 模擬樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線

在以未發(fā)酵蘋果汁為基質(zhì)的模擬樣品的檢測(cè)中，以模擬樣品各梯度濃度所含菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值（lg（CFU/mL）） 為橫坐標(biāo)，以運(yùn)行過程中Ct 值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3 看出，模擬樣品這兩條件之間有著較好的線性關(guān)系，這就證明這個(gè)試驗(yàn)方法是行得通的。

2.4 未知樣品檢測(cè)結(jié)果

發(fā)酵蘋果汁的嗜酸乳桿菌中提取出的DNA 經(jīng)設(shè)置好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法分析，檢測(cè)計(jì)算得出嗜酸乳桿菌的含量為2.27×108CFU/mL，最終定量結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法所得結(jié)果（菌落數(shù)=2.32×108CFU/mL） 基本一致。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法可以準(zhǔn)確有效地定量蘋果汁中的嗜酸乳桿菌。

3 結(jié)論

用于熒光定量PCR 的DNA 模板有一定的純度要求，因此要選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛悠分械腄NA。果蔬基質(zhì)中核酸提取的干擾因素相對(duì)較少，用試劑盒法（帶吸附柱） 提取比較合適[12]，上邊試驗(yàn)中目標(biāo)菌DNA 提取就選用的該法。

對(duì)于乳酸菌飲料中活菌的檢測(cè)，現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)采用的是平板計(jì)數(shù)法，該方法最大的缺點(diǎn)是樣品檢測(cè)周期長，難以滿足食品行業(yè)準(zhǔn)確鑒定和快速檢測(cè)的發(fā)展需要。因此，運(yùn)用基于PCR 的分子學(xué)方法尤其是RT-PCR 技術(shù)更具實(shí)際發(fā)展意義。Guo Z H 等人[13-14]通過實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)發(fā)酵物中嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量定性。吳榮榮等人[15]選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)發(fā)酵乳中的德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌實(shí)施定量分析，最終數(shù)據(jù)顯示與平板計(jì)數(shù)得到的菌的數(shù)目基本一致。以上列出的研究都有效表明了實(shí)時(shí)熒光定量PCR法非常適合于乳酸菌發(fā)酵飲品的快速計(jì)數(shù)，且定量過程相對(duì)較快，還可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的同時(shí)檢測(cè)和自動(dòng)化[16]。其超高靈敏度和良好的重復(fù)性在姜鴻瑞等人[17-18]建立的熒光定量分子檢測(cè)方法中也被充分驗(yàn)證。