劉鳳霞，李慕軍

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院廣西生殖醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021)

化療性卵巢功能不全是一種醫(yī)源性疾病，表現(xiàn)為化療后出現(xiàn)卵泡閉鎖、卵巢儲(chǔ)備持續(xù)下降、生育力低下、卵巢功能減退甚至衰竭，最終發(fā)展為絕經(jīng)，目前缺乏有效的治療措施。兒童和育齡期女性是生育力保存的重點(diǎn)人群，該人群好發(fā)的惡性腫瘤包括白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、生殖系統(tǒng)腫瘤等，化療藥物廣泛應(yīng)用于上述惡性腫瘤以及其他非惡性疾病(如自身免疫性疾病等)的治療[1]。常用的化療藥物包括烷基化藥物(環(huán)磷酰胺、白消安等)、鉑類(lèi)復(fù)合物(順鉑等)、蒽環(huán)類(lèi)(阿霉素等)、紫杉烷類(lèi)(多西紫杉醇等)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(依托泊苷)和植物生物堿(長(zhǎng)春花堿)等。其中，烷基化藥物的卵巢毒性最大，其次是鉑類(lèi)、蒽環(huán)類(lèi)[2-3](文中提及的化療藥物特指這三類(lèi)化療藥)。為了研究確切有效的卵巢保護(hù)劑，需要深入了解化療藥物對(duì)卵巢的損傷機(jī)制。目前具體的分子機(jī)制尚不明確，本綜述基于自噬探討化療性卵巢功能不全的作用機(jī)制。

自噬是將內(nèi)源或外源的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解的過(guò)程[4]。經(jīng)典自噬過(guò)程包括雙層膜自噬小體的形成、自噬小體與溶酶體的融合、自噬溶酶體內(nèi)物質(zhì)的降解。自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes，ATG)參與調(diào)控自噬的各個(gè)環(huán)節(jié)。自噬屬于細(xì)胞程序性死亡的一種表現(xiàn)形式，其生理功能包括適應(yīng)應(yīng)激、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，參與機(jī)體分化和發(fā)育，防止基因組損傷，清除有害物質(zhì)、避免不必要的物質(zhì)在體內(nèi)堆積等。在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬發(fā)揮著“雙刃劍”的作用，一方面對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)促進(jìn)了細(xì)胞生存，另一方面過(guò)度激活或抑制會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞死亡。

化療藥物對(duì)卵巢功能的損傷表現(xiàn)為不同生長(zhǎng)階段的卵泡丟失，尤其是原始卵泡的顯著減少?；熀舐殉彩Ｓ嗟脑悸雅輸?shù)目直接決定了之后的卵巢生殖壽命。保護(hù)生育力的重點(diǎn)在于避免或減少化療藥物的對(duì)原始卵泡的損傷。目前化療藥物損傷卵巢功能的機(jī)制主要包括以下兩種假說(shuō)：激活卵巢細(xì)胞的死亡途徑，原始卵泡的過(guò)度激活。

一、化療藥物激活卵巢細(xì)胞的死亡途徑

化療藥物對(duì)卵巢細(xì)胞造成的DNA損傷，或通過(guò)增加氧自由基、破壞卵巢微血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)卵巢細(xì)胞造成的間接損傷，均會(huì)激活細(xì)胞死亡途徑。早期的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，化療后的細(xì)胞凋亡增加，因此認(rèn)為凋亡是化療性卵巢功能不全的主要機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，應(yīng)用環(huán)磷酰胺后，抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)減少，促凋亡蛋白BAX的表達(dá)增加，這些效應(yīng)共同誘導(dǎo)細(xì)胞DNA斷裂，當(dāng)細(xì)胞DNA損傷的積累超過(guò)了DNA修復(fù)的閾值時(shí)，卵巢細(xì)胞凋亡上調(diào)[5-7]。還有研究顯示，環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致異種移植小鼠的人卵巢皮質(zhì)內(nèi)大量卵泡丟失和DNA片段化，而抗凋亡試劑1-磷酸鞘氨醇可以阻止卵泡凋亡，并維持原始卵泡數(shù)量[8]。經(jīng)阿霉素處理的顆粒細(xì)胞，可觀察到活性氧和超氧化物的積累，以及線粒體膜電位的降低，阿霉素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進(jìn)了線粒體介導(dǎo)的凋亡[9]。此外，阿霉素還可以通過(guò)TAp63途徑直接誘導(dǎo)原始卵泡的丟失[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，順鉑觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體活性氧反應(yīng)，通過(guò)激活Caspase通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一些抗凋亡分子可以減少部分卵泡丟失，但效果并不確切，因此尚不清楚是否啟動(dòng)了其他細(xì)胞死亡途徑。

凋亡是Ⅰ型細(xì)胞程序性死亡，自噬是Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡。兩者都是由多種類(lèi)型的應(yīng)激因子激活的，并受多個(gè)共享分子的調(diào)控。那么自噬是否也參與了化療性卵泡丟失的機(jī)制呢？一般而言，自噬抑制凋亡，是細(xì)胞的存活途徑；但若體內(nèi)環(huán)境失衡，自噬也可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在卵泡發(fā)育和閉鎖過(guò)程中，自噬和凋亡在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中共存。在缺乏生長(zhǎng)因子的情況下，為了維持細(xì)胞的生存，自噬是通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)誘導(dǎo)的。然而，在極端的應(yīng)激條件下，過(guò)度的自噬可能會(huì)剝奪卵泡在卵母細(xì)胞發(fā)生的最后階段所需的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子、生存因子和細(xì)胞周期蛋白，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[12]。此外，自噬小體的積累很可能是誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵事件，通過(guò)降低BCL-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活Caspase來(lái)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡[13]。自噬的調(diào)節(jié)還可以通過(guò)與凋亡蛋白的相互作用發(fā)生，自噬核心蛋白BECN1含有一個(gè)BH3結(jié)合域，BCL-2可與其結(jié)合[14]。在正常情況下，BECN1與BCL-2結(jié)合并抑制自噬，但在應(yīng)激作用下，BECN1與BCL-2解離，從而激活自噬。Madden等[15]應(yīng)用環(huán)磷酰胺活性代謝物建立了大鼠卵巢體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，檢測(cè)了自噬和凋亡的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)可導(dǎo)致卵泡丟失，并同時(shí)觀測(cè)到自噬核心基因BECN1 mRNA和蛋白的表達(dá)均上調(diào)，而卵泡丟失被認(rèn)為主要是通過(guò)獨(dú)立于 Caspase 的途徑(凋亡的經(jīng)典通路)發(fā)生的。凋亡與自噬具有密切的交互作用，自噬有可能與凋亡共同介導(dǎo)了卵泡丟失。在進(jìn)行化療性卵巢功能不全的研究時(shí)，應(yīng)該注意自噬和凋亡之間的調(diào)控關(guān)系。

此外，化療藥物造成的細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、缺血缺氧的應(yīng)激也可直接影響自噬。自噬的過(guò)度激活或抑制最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡?；熕幬镏饕饔糜谏L(zhǎng)代謝旺盛的細(xì)胞，卵巢顆粒細(xì)胞有絲分裂指數(shù)高，是化療藥物的靶細(xì)胞之一。顆粒細(xì)胞環(huán)繞卵母細(xì)胞，通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞傳遞信號(hào)，與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)或死亡密切相關(guān)。有研究表明，分離大鼠的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用環(huán)磷酰胺的活性代謝物進(jìn)行干預(yù)，經(jīng)藥物誘導(dǎo)后的顆粒細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生，自噬相關(guān)蛋白BECN1表達(dá)上調(diào)，當(dāng)自噬過(guò)度激活時(shí)，顆粒細(xì)胞內(nèi)的成分會(huì)過(guò)度自我降解，最終表現(xiàn)為卵泡丟失增加[16]。另一項(xiàng)研究應(yīng)用順鉑誘導(dǎo)人源卵巢顆粒細(xì)胞(KGN細(xì)胞、COV434細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)4 h內(nèi)顆粒細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)，8～16 h內(nèi)自噬被激活，24 h出現(xiàn)細(xì)胞凋亡；與未處理的顆粒細(xì)胞相比，藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞的自噬、凋亡水平上調(diào)[17]。根據(jù)結(jié)果推測(cè)，順鉑的毒性作用誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活了自噬，進(jìn)而降解了細(xì)胞成分，維持細(xì)胞的存活。然而，過(guò)度激活的自噬最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也有類(lèi)似的結(jié)果。Lu等[18]通過(guò)腹腔注射順鉑誘導(dǎo)卵巢功能不全的大鼠模型，取卵巢卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)自噬小體增加、自噬活性上調(diào)；應(yīng)用自噬抑制劑處理后，自噬活性被抑制，正常卵泡數(shù)量增加、卵泡閉鎖減少。由此推測(cè)，自噬的激活誘導(dǎo)了化療性卵巢功能不全的發(fā)生，但是否為發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)、是否同時(shí)涉及其他途徑，尚未明確。

二、化療藥物誘導(dǎo)原始卵泡的過(guò)度激活

相對(duì)于休眠的原始卵泡，發(fā)育中卵泡和有絲分裂活躍的顆粒細(xì)胞更容易受到化療藥物的影響。因此有學(xué)者提出，卵泡的丟失歸因于原始卵泡在化療后短期內(nèi)發(fā)生的過(guò)度激活和募集[19]。在生理狀態(tài)下，卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育處于平衡狀態(tài)，以維持一定數(shù)量的生長(zhǎng)卵泡。原始卵泡受到多種信號(hào)通路、激活因子和抑制因子的調(diào)控，絕大多數(shù)原始卵泡處于休眠狀態(tài)，只有極少數(shù)被激活處于生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)應(yīng)用具有性腺毒性的化療藥物時(shí)，卵巢內(nèi)Hippo、PI3K/PTEN/AKT/mTOR、JNK、TGFβ、JAK/STAT、MAPK等信號(hào)通路被激活，觸發(fā)了原始卵泡過(guò)度激活和募集，最終導(dǎo)致卵泡的耗損[20]。在小鼠和培養(yǎng)的人類(lèi)卵巢組織中[21-23]，與對(duì)照組相比，順鉑/環(huán)磷酰胺組的原始卵泡數(shù)量明顯減少，但沒(méi)有觀察到凋亡增加的現(xiàn)象；早期生長(zhǎng)卵泡數(shù)量增加、凋亡特征的發(fā)生率增加。進(jìn)一步的蛋白分析顯示，經(jīng)順鉑處理后的小鼠卵巢內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)，激活了PI3K/AKT/FOXO3通路，使FOXO3a從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，激活了休眠的原始卵泡，激活后的原始卵泡更容易發(fā)生凋亡，最終導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備損耗。此外，有研究表明，當(dāng)順鉑、環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)生長(zhǎng)卵泡大量凋亡，原始卵泡激活的抑制因子(如AMH等)的分泌急劇減少[24-25]。為了補(bǔ)充丟失的生長(zhǎng)卵泡、維持生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量，原始卵泡過(guò)度激活，短期內(nèi)對(duì)化療藥物敏感的生長(zhǎng)卵泡增多，最終導(dǎo)致卵泡的耗損。類(lèi)似的，阿霉素靶向作用于生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞和原始卵泡的卵母細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)生長(zhǎng)卵泡閉鎖和過(guò)度激活原始卵泡來(lái)破壞小鼠的卵巢儲(chǔ)備[26]。

根據(jù)已有的研究，化療藥物可通過(guò)不同的途徑，誘導(dǎo)原始卵泡過(guò)度激活和生長(zhǎng)卵泡閉鎖，并與卵泡丟失的結(jié)局密切相關(guān)。而自噬被認(rèn)為參與了原始卵泡的激活和生長(zhǎng)卵泡的閉鎖?；熕幬镉绊懧殉矁?chǔ)備的信號(hào)通路和自噬相關(guān)信號(hào)通路具有交互性，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。兩者共同的信號(hào)通路主要包括氧自由基誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、PI3K/AKT/mTOR通路、JNK通路等。其中，mTOR信號(hào)通路是自噬調(diào)控中最為重要的通路之一，通路中的mTORC1是自噬的負(fù)性調(diào)控因子，當(dāng)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)剝奪、饑餓、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)，mTOR通路被抑制，最終誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR，激活自噬可以保護(hù)卵泡池儲(chǔ)備，延長(zhǎng)雌性大鼠的卵巢壽命[27]。在動(dòng)物模型中，自噬核心基因(ATG7、ATG9、BECN1)敲除或突變，原始卵泡儲(chǔ)備下降、新生小鼠出生后的生殖細(xì)胞過(guò)度丟失[28-29]。當(dāng)給予新生小鼠特異性自噬激活劑或出生后饑餓誘導(dǎo)自噬時(shí)，原始卵泡的數(shù)量增加[30-31]。通過(guò)對(duì)不同階段卵泡的細(xì)胞成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)自噬主要發(fā)生在卵巢顆粒細(xì)胞中，顆粒細(xì)胞自噬可能直接參與了卵泡發(fā)育的各個(gè)階段的卵泡閉鎖環(huán)節(jié)[32]。此外，有研究表明，自噬在變形的卵泡和退化的黃體中表現(xiàn)為死亡機(jī)制[33]。因此推測(cè)自噬在卵巢中卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育具有復(fù)雜的調(diào)控趨勢(shì)：維持原始卵泡池的大小，同時(shí)也可以誘導(dǎo)各級(jí)卵泡的閉鎖。自噬與卵泡的生存或死亡密切相關(guān)。然而，自噬在化療后原始卵泡激活的具體作用是激活還是抑制尚不清楚，還有待闡明。

在進(jìn)行抗腫瘤以及對(duì)非腫瘤性疾病治療時(shí)，需要同時(shí)關(guān)注保護(hù)患者的生育力[34]。自噬在化療性卵巢功能不全中的作用及機(jī)制目前尚不明確，有待深入研究。過(guò)度的自噬激活可誘導(dǎo)卵巢細(xì)胞的死亡途徑，而生理情況下的自噬可以保護(hù)原始卵泡避免過(guò)度激活。自噬的促細(xì)胞存活途徑和促細(xì)胞死亡途徑有可能相互獨(dú)立地進(jìn)行調(diào)控，并在不同類(lèi)型的卵巢細(xì)胞發(fā)揮不同的作用。研究化療藥物誘導(dǎo)卵巢功能損害的分子機(jī)制具有重要的臨床意義，正確運(yùn)用自噬促進(jìn)劑和抑制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)化療后生育力的保存，可能為臨床治療提供新的思路，減少或預(yù)防化療藥物介導(dǎo)的卵巢衰竭和不孕，實(shí)現(xiàn)腫瘤患者的生育力保存。