王金玉，陳圓輝，王倩，張嘯龍，張杰平，范英英，張翠蓮

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南省人民醫(yī)院，鄭州 450003)

卵母細(xì)胞數(shù)量減少、質(zhì)量降低，導(dǎo)致生殖能力下降，最終表現(xiàn)為生殖能力喪失或絕經(jīng)，稱為卵巢儲備功能減退(DOR)。大約10%的不孕婦女患有DOR[1]，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、女性生育年齡延遲等因素，利用輔助生殖技術(shù)(ART)助孕的DOR患者逐年增多，并且呈年輕化趨勢。因此，對于<35歲的年輕不孕女性，及早診斷DOR將有利于預(yù)測卵巢低反應(yīng)，以期制定個體化治療措施達(dá)到盡早生育的目的。神經(jīng)肽吻素(Kisspeptin)是調(diào)節(jié)女性生殖內(nèi)分泌的關(guān)鍵神經(jīng)肽，主要通過在上游調(diào)節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌，進(jìn)而調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸。研究表明，很多生殖內(nèi)分泌疾病，如卵巢早衰(POF)、低促性腺激素性性腺功能減退癥、多囊卵巢綜合征、病理性高泌乳素血癥等，都與Kisspeptin的異常表達(dá)有關(guān)[2]。但是，Kisspeptin作為重要的生殖激素，其與DOR發(fā)病相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究擬采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗(yàn)法檢測DOR患者血清基礎(chǔ)Kisspeptin(bKisspeptin)水平，并繪制受試者特征工作曲線(ROC)以探討其對DOR的診斷價(jià)值，以期為早期診斷DOR并制定合理的治療方案提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

收集2020年7月至2021年1月于我院生殖醫(yī)學(xué)中心首次經(jīng)ART助孕的不孕癥患者的臨床資料，根據(jù)卵巢儲備功能檢查結(jié)果分為DOR不孕癥組(DOR組)和卵巢功能正常的不孕癥組(對照組)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)對照組患者要求均有排卵，月經(jīng)周期正常，基礎(chǔ)性激素水平正常，月經(jīng)第3天竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)7～20個，僅因輸卵管因素或男方因素導(dǎo)致不孕；(2)DOR組患者要求符合DOR診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]：月經(jīng)第3天(月經(jīng)紊亂者可于超聲檢查未見優(yōu)勢卵泡時(shí))AFC<7個、抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)≥10 U/L，3項(xiàng)中符合2項(xiàng)并排除輸卵管因素或男方因素導(dǎo)致不孕的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在染色體異常；(2)存在其他影響Kisspeptin水平的相關(guān)疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、多囊卵巢綜合征、低促性腺激素性性腺功能減退癥、高泌乳素血癥等；(3)近3個月內(nèi)應(yīng)用激素類藥物治療者；(4)糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等內(nèi)分泌代謝疾病患者。

共納入145例患者，其中DOR組80例，對照組65例。

本研究通過河南省人民醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.樣本收集：于月經(jīng)周期第3天(月經(jīng)紊亂者可于超聲檢查未見優(yōu)勢卵泡時(shí))，清晨空腹采集外周靜脈血 5 ml，于室溫靜置30 min，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.基礎(chǔ)激素水平檢測：血清bKisspeptin水平檢測采用ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物)，并按照說明書進(jìn)行操作。將試劑和樣本緩慢恢復(fù)至室溫，酶標(biāo)板中加入100 μl/孔待測樣本，在各孔中加入50 μl的酶標(biāo)記溶液(不含空白對照孔)，37℃孵育反應(yīng)1 h后充分清洗酶標(biāo)板3～5次；用吸水紙徹底拍干酶標(biāo)板后各孔加入顯色劑A、B各50 μl，20～25℃下避光反應(yīng)10 min，各孔滴加50 μl終止液，立即用酶標(biāo)儀(BioTek，美國)測量各孔450 nm的光密度值(OD)，并以PBS為空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待測樣本含量。血清AMH、bFSH、基礎(chǔ)黃體生成素(bLH)、基礎(chǔ)雌二醇(bE2)等性激素水平采用電化學(xué)發(fā)光儀(Elecsys e602，羅氏，瑞士)檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位間距)[M(P25，P75)]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；相關(guān)因素的分析采用Spearman相關(guān)性分析法；應(yīng)用ROC曲線分析血清bKisspeptin的診斷效能。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

兩組間年齡和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較均無顯著差異(P>0.05)；DOR組血清bKisspeptin、bFSH、bLH水平均顯著高于對照組，而血清AMH、AFC、bE2水平均顯著低于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較[M(P25，P75)]

二、血清bKisspeptin水平與卵巢儲備功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DOR患者血清bKisspeptin與bFSH、bLH水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與AMH、AFC呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與年齡、BMI、血清bE2水平無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)(表2)。

表2 DOR患者血清bKisspeptin與卵巢儲備功能指標(biāo)的相關(guān)性

三、血清bKisspeptin及卵巢儲備功能指標(biāo)對DOR的診斷效能

ROC曲線分析顯示，血清bKisspeptin診斷DOR的曲線下面積(AUC)為0.87，截?cái)嘀禐?18.42 pg/ml，敏感性68.75%，特異性89.23%；血清AMH診斷DOR的AUC為0.97，截?cái)嘀禐?.17 ng/ml，敏感性87.50%，特異性95.38%；AFC診斷DOR的AUC為0.96，截?cái)嘀禐?.00個，敏感性95.00%，特異性84.62%；血清bFSH診斷DOR的AUC為0.95，截?cái)嘀禐?.24 U/L，敏感性93.75%，特異性89.23%，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3，圖1)。

表3 血清bKisspeptin及卵巢儲備功能指標(biāo)對DOR的診斷效能

圖1 血清bKisspeptin及各卵巢儲備功能指標(biāo)對DOR的診斷效能分析

四、不同年齡組中血清bKisspeptin水平對DOR的診斷效能分析

眾所周知，年齡是影響卵母細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量的首要因素，也是卵巢反應(yīng)性的獨(dú)立預(yù)測因子[5]。因此，本研究進(jìn)一步根據(jù)患者年齡分為兩個亞組，即<35歲低齡組和≥35歲高齡組。

ROC曲線對比分析顯示，低齡組血清bKisspeptin診斷DOR的AUC為0.93，顯著大于高齡組的0.84和未年齡分組的0.87(P<0.05)；低齡組血清bKisspeptin鑒別DOR的截?cái)嘀禐?00.68 pg/ml，顯示敏感性73.53%、特異性96.55%(P<0.05)；高齡組血清bKisspeptin鑒別DOR的截?cái)嘀禐?16.92 pg/ml，顯示敏感性93.48%、特異性61.11%(P<0.05)(表4，圖2)。

表4 不同年齡患者血清bKisspeptin對DOR的診斷效能

A：低齡組；B：高齡組圖2 各年齡組血清bKisspeptin對DOR的診斷效能分析

討 論

DOR也稱卵巢儲備功能低下，以生育力下降、卵巢儲備功能指標(biāo)變化、排卵障礙、月經(jīng)不調(diào)、不孕為病理特征。近年來DOR患者越來越多，且呈年輕化趨勢，尋求ART治療的<35歲的年輕DOR不孕患者也逐漸增加，及早診斷DOR，將有利于預(yù)測卵巢低反應(yīng)、制定個體化治療措施，達(dá)到盡早生育的目的[6]。另外，嚴(yán)重DOR患者的卵巢生殖功能會逐漸下降，發(fā)展為早發(fā)性卵巢功能不全(POI)，甚至發(fā)展為POF，導(dǎo)致女性生育力喪失或絕經(jīng)。研究發(fā)現(xiàn)，DOR是連續(xù)的過程，其病程可分為4個階段：(1)基礎(chǔ)促性腺激素正常，但促排卵出現(xiàn)卵巢低反應(yīng)為隱匿期；(2)基礎(chǔ)促性腺激素水平升高，促排卵出現(xiàn)卵巢低反應(yīng)為生化期；(3)基礎(chǔ)促性腺激素顯著上升、生育能力顯著下降，并且出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)，甚至伴隨因雌激素缺乏所致的一系列癥狀為顯性期；(4)原始卵泡處于不可逆的耗竭狀態(tài)的為POF期[7-8]。為了及早發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)卵巢功能減退的患者，歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會在2016年發(fā)表指南[9]，將POF診斷前移，提出“POI”概念，并將bFSH的診斷閾值由40 U/L下調(diào)到25 U/L。我國2017年于《中華婦產(chǎn)科雜志》發(fā)表的專家共識提出“亞臨床期POI”概念，將bFSH診斷閾值下調(diào)為15～25 U/L[10]。實(shí)際上，bFSH的波動范圍非常大，即使是POI的患者，bFSH也有可能在正常范圍內(nèi)，但當(dāng)bFSH高達(dá)25 U/L時(shí)，使用ART治療的成功率己經(jīng)很低。因此本研究納入DOR患者以bFSH≥10 U/L為診斷閾值，以期發(fā)現(xiàn)新的早期DOR診斷指標(biāo)，以利于患者及時(shí)進(jìn)行ART或生育力保存治療，并通過盡早干預(yù)，減緩其DOR的進(jìn)程。

Kisspeptin是調(diào)節(jié)女性生殖內(nèi)分泌關(guān)鍵信號因子，主要在GnRH神經(jīng)元的上游起作用。下丘腦內(nèi)Kisspeptin神經(jīng)元位于下丘腦的弓狀核(ARC)和前腹側(cè)室周核(AVPV)。研究發(fā)現(xiàn)，ARC的Kisspeptin神經(jīng)元主要接受E2的負(fù)反饋，AVPV的Kisspeptin神經(jīng)元主要接受E2的正反饋。并且，ARC的Kisspeptin神經(jīng)元不僅表達(dá)Kisspeptin，還共表達(dá)神經(jīng)激肽B(NKB)和強(qiáng)啡肽(Dyn)，因此也被稱作Kisspeptin/神經(jīng)激肽B/強(qiáng)啡肽(KNDy)神經(jīng)元[11]。AVPV的Kisspeptin神經(jīng)元和ARC的KNDy神經(jīng)元共同調(diào)控GnRH的分泌，從而調(diào)控生殖軸[11]。目前，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，生殖內(nèi)分泌疾病與Kisspeptin異常表達(dá)有關(guān)，如低促性腺激素性性腺功能減退癥、多囊卵巢綜合征、病理性高泌乳素血癥等。翟君鈺[8]發(fā)現(xiàn)，POI和POF不孕女性的血清bKisspeptin顯著高于正常對照組。師紅美等[12]利用6周齡雌性balb/c小鼠建立POF模型，免疫組化結(jié)果顯示，POF小鼠卵巢次級卵泡中表達(dá)Kisspeptin的陽性細(xì)胞數(shù)比對照組顯著減少，提示Kisspeptin信號通路可能參與POF的發(fā)病機(jī)制。然而，張艷婷[13]研究發(fā)現(xiàn)，月經(jīng)第2～3天DOR患者血清bKisspeptin水平與對照組比較無顯著差異，但該研究納入的樣本量較小，且部分患者基礎(chǔ)血清采集時(shí)期為口服避孕藥、孕激素撤退性出血的第2～3天，因此，無法排除激素類藥物對bKisspeptin水平的影響。另外，Zhai等[14]對正常育齡女性血清Kisspeptin在月經(jīng)周期中的變化情況進(jìn)行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)月經(jīng)第3天血清Kisspeptin較低，而在月經(jīng)期第11天時(shí)優(yōu)勢卵泡生長約達(dá)1.2 cm時(shí)出現(xiàn)血清Kisspeptin峰值。最近，Abbara等[15]皮下注射Kisspeptin-54對女性患者進(jìn)行促排卵治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射后卵母細(xì)胞成熟率增加，注射Kisspeptin-54的12 h內(nèi)LH和孕酮水平激增，更進(jìn)一步顯示了Kisspeptin參與促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟及誘導(dǎo)排卵。

鑒于DOR不孕女性的血清bKisspeptin水平鮮有研究，以及血清Kisspeptin水平與卵泡生長發(fā)育有一定關(guān)聯(lián)，本研究選擇在月經(jīng)第3天(月經(jīng)紊亂者可于超聲檢查未見優(yōu)勢卵泡時(shí))采集DOR患者血清測定bKisspeptin水平。本研究結(jié)果顯示，DOR組血清bKisspeptin水平與bFSH、bLH水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明下丘腦分泌的Kisspeptin作為GnRH的上游調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控bFSH和bLH的分泌。另外，本研究結(jié)果顯示，DOR患者血清bKisspeptin與AMH、AFC呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說明血清bKisspeptin可能與DOR密切相關(guān)。與對照組比較，DOR患者血清AMH、AFC、bE2水平顯著降低，而血清bKisspeptin、bFSH水平則顯著升高(P<0.05)，推測其可能作用于卵泡起始階段，由于DOR患者AFC數(shù)減少，其血清bE2水平降低，從而使得bE2的負(fù)反饋信號傳遞給ARC的KNDy神經(jīng)元，KNDy神經(jīng)元被激活后引起Kisspeptin、NKB、Dyn分泌增加，而此時(shí)Dyn誘發(fā)低頻率的GnRH脈沖導(dǎo)致血清bFSH分泌增加，刺激卵泡的募集和生長。關(guān)于血清bKisspeptin對DOR的診斷價(jià)值，本研究結(jié)果表示，未進(jìn)行年齡分組時(shí)，血清bKisspeptin診斷DOR的AUC為0.87，顯著低于AMH、AFC、bFSH診斷DOR的AUC(P<0.05)。眾所周知，年齡是影響卵母細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量的首要因素，也是卵巢反應(yīng)性的獨(dú)立預(yù)測因子[5]。因此，本研究進(jìn)一步根據(jù)年齡分組發(fā)現(xiàn)，<35歲患者的血清bKisspeptin診斷DOR的ROC-AUC為0.93，敏感度73.53%，特異度96.55%，提示血清bKisspeptin是一個較為理想的診斷標(biāo)志物，尤其是對于<35歲的年輕DOR患者診斷效能更高。

由于本研究屬于單中心、小樣本研究，結(jié)論可能存在一定的偏倚，后期尚需要更多高質(zhì)量、多中心、大規(guī)模的研究加以探討證實(shí)。

綜上所述，血清bKisspeptin水平檢測能夠?yàn)镈OR患者的早期診斷提供理論依據(jù)，尤其對<35歲的年輕DOR不孕女性的診斷價(jià)值較高。DOR過程是不可逆的，與≥35歲患者相比，<35歲DOR患者行ART仍然可以獲得較好的臨床妊娠結(jié)局[16]。臨床上若發(fā)現(xiàn)患者不孕或月經(jīng)紊亂，但是基礎(chǔ)促性腺激素尚未出現(xiàn)異常或異常程度較輕微，可通過檢測血清bKisspeptin水平協(xié)助預(yù)測其卵巢功能是否減退，為卵巢功能預(yù)測提供新的檢測指標(biāo)。