邵帥，江梅，丁濤，姜經(jīng)航，王開(kāi)秀，王婷婷，向翠玲

(湖北省荊門市第二人民醫(yī)院 1.生殖醫(yī)學(xué)科；2.創(chuàng)傷-骨腫瘤外科，荊門 448000)

全球約有10%～15%的不孕不育夫婦，這些病例中約50%與男性有關(guān)，原因不明的男性不育的發(fā)生率約為15%[1]。卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)是通過(guò)注射針將選擇的形態(tài)正常的單個(gè)精子注射到卵母細(xì)胞內(nèi)使其受精的技術(shù)。自然受精是精子進(jìn)入生殖道，去除精漿、穿透宮頸粘液、獲能、前進(jìn)到輸卵管壺腹部，與卵子結(jié)合受精并通過(guò)一系列反應(yīng)穿過(guò)卵丘細(xì)胞層、透明帶和卵膜等極其嚴(yán)格的選擇過(guò)程，就是為了選擇最有活力、DNA完整性好、成熟的精子與卵母細(xì)胞結(jié)合，得到高質(zhì)量的胚胎[2]。ICSI則繞過(guò)了所有的自然選擇屏障(卵丘細(xì)胞層、透明帶和卵膜)。雖然ICSI對(duì)注射的精子要求比較高，通過(guò)將精子放大200～400倍，甚至放大到6 000倍觀察并選擇形態(tài)正常的精子，但只能有效選擇形態(tài)正常的精子，而有些形態(tài)正常的精子，其DNA完整性比較差，碎片比較多[3]。因此，從ICSI胚胎質(zhì)量以及臨床結(jié)局角度考慮出發(fā)，本文從進(jìn)行ICSI時(shí)精子的選擇方法作一綜述，以便為臨床ICSI提供有效參考。

一、低滲腫脹試驗(yàn)

低滲透腫脹試驗(yàn)(HOST)最初作為精子的診斷試驗(yàn)，對(duì)精子質(zhì)膜的功能完整性進(jìn)行評(píng)估。在低滲條件下，精子尾部由于水的進(jìn)入而出現(xiàn)正常的功能膜膨脹或卷曲，目前在臨床實(shí)踐中作為精子存活的可靠指標(biāo)[4]。HOST可用于睪丸或附睪穿刺取出的精子、睪丸切開(kāi)顯微取精的精子以及少弱精子癥患者手淫法取出的精子等，通過(guò)該方法可以篩選出完全不動(dòng)但有活力的精子。Bloch等[5]通過(guò)HOST將精子按A到G進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HOST選擇的精子與未經(jīng)選擇的精子相比較，HOST分類為B類和B+類的精子質(zhì)量最高(低DNA碎片，低DNA去濃縮，端粒間距離短，染色體1區(qū)域小)。Casper等[6]通過(guò)HOST選擇不活動(dòng)但有活力的精子，與隨機(jī)選擇精子相比，受精率從26%提高到43%，卵裂率從23%增加到39%。Charehjooy等[7]研究表明HOST的應(yīng)用可以使胚胎具有更高的發(fā)育潛力、著床率以及妊娠率。此外，在IVF完全受精失敗的下一個(gè)ICSI周期中使用HOST，可以獲得更好質(zhì)量的精子。

以上研究表明了HOST的有效性，并建議將其作為行ICSI之前的常規(guī)操作。盡管尚未有研究證明HOST的有害作用，但胚胎實(shí)驗(yàn)室在決定使用HOST時(shí)，應(yīng)該考慮其實(shí)踐運(yùn)用、使用標(biāo)準(zhǔn)，并與患者簽訂相關(guān)知情協(xié)議。

二、激光輔助不動(dòng)精子選擇

激光輔助不動(dòng)精子選擇(LAISS)是在行ICSI之前高倍視野下選擇形態(tài)較好的不動(dòng)精子，在靠近精子尾巴尖端處激光射擊，存活精子在射擊后精子尾部會(huì)立即出現(xiàn)卷尾或折角現(xiàn)象，但此方法不會(huì)對(duì)精子DNA造成損害。國(guó)內(nèi)研究顯示LAISS能有效篩選睪丸中存活的不動(dòng)精子，改善ICSI的實(shí)驗(yàn)室結(jié)局，提高其正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率等[8]。LAISS可以有效鑒別極重度弱精子的存活情況，這些存活的極重度弱精子通過(guò)ICSI可以達(dá)到與正常精子ICSI相同的受精率，而且有助于提高卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率，但激光導(dǎo)致精子尾部卷曲的機(jī)制尚不清楚，可能與激光照射后介質(zhì)流入精子尾部有關(guān)[9]。2017年報(bào)道了一例使用LAISS技術(shù)選擇的完全不動(dòng)但存活的冷凍復(fù)蘇精子，進(jìn)行ICSI受精后成功妊娠的病例，為數(shù)量較少的不動(dòng)精子的處理提供了新的思路[10]。Ozkavukcu等[11]通過(guò)LAISS提取抗己酮可可堿的靜止精子進(jìn)行ICSI，移植雙囊胚后獲得健康的三胞胎。也有其他研究顯示LAISS-ICSI與傳統(tǒng)的ICSI相比，雖然能夠提高卵母細(xì)胞存活率，但囊胚形成率、質(zhì)量和利用率均下降[12]。

就目前文獻(xiàn)所顯示的沖突結(jié)果，LAISS-ICSI似乎不是提高ICSI成功率的最佳解決方案，仍需要大量的研究來(lái)證實(shí)LAISS-ICSI的成功率。也需要更多的研究和改進(jìn)措施來(lái)闡明LAISS作為行ICSI前不動(dòng)精子常規(guī)選擇的潛力及激光對(duì)胚胎發(fā)育的潛在影響機(jī)制。

三、偏振光顯微鏡選擇精子

成熟精子的細(xì)胞核具有固有的雙折射，偏振光顯微鏡就是根據(jù)精子雙折射現(xiàn)象對(duì)精子進(jìn)行選擇。精子頭的雙折射可以作為反映其細(xì)胞核正常結(jié)構(gòu)組織的指標(biāo)。雙折射也可以評(píng)估頂體反應(yīng)的狀態(tài)，因?yàn)槌墒斓木釉谡麄€(gè)頭部表現(xiàn)出雙折射，而發(fā)生頂體反應(yīng)的精子僅在頂體后區(qū)存在雙折射[13]。Magli等[14]發(fā)現(xiàn)位于頂體后區(qū)的雙折射與反應(yīng)性頂體以及DNA完整性密切相關(guān)，是成熟精子的可靠指標(biāo)。此外，雙折射模式與精子活力和正常形態(tài)之間有一定的相關(guān)性，形態(tài)異?；蚧盍Σ畹木泳哂挟惓ｋp折射模式，且形態(tài)與雙折射特性的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)[14]。ICSI時(shí)選擇偏振光下存在雙折射的精子，受精后原核評(píng)分為Z1和Z2的顯著多于非選擇組，而且弱精子癥患者的精子行ICSI時(shí)，通過(guò)雙折射選擇精子得到的妊娠結(jié)局比HOST選擇的精子得到的妊娠結(jié)局更好[15]。2008年，Gianaroli等[16]利用雙折射選擇精子進(jìn)行ICSI，與傳統(tǒng)ICSI方法相比，通過(guò)偏光顯微鏡選擇的精子可以獲得更好的胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局。兩年后，該小組基于頂體完整性(發(fā)生頂體反應(yīng)和未發(fā)生頂體反應(yīng)的精子)及其與輔助生殖技術(shù)(ART)結(jié)果的關(guān)系評(píng)估了雙折射模式的作用，認(rèn)為發(fā)生頂體反應(yīng)的精子和未發(fā)生頂體反應(yīng)的精子的受精率和胚胎發(fā)育均沒(méi)有顯著差異，但注射發(fā)生頂體反應(yīng)的精子可以獲得更高的著床率和臨床妊娠率[17]。

盡管取得了這些成果，但還需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證該方法。另外，對(duì)精子頭部雙折射模式的評(píng)估是基于形態(tài)學(xué)檢查，需要熟練的胚胎學(xué)家正確地執(zhí)行這項(xiàng)技術(shù)。

四、運(yùn)動(dòng)精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢查

運(yùn)動(dòng)精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢查(MSOME)是一種通過(guò)超高倍顯微鏡將精子放大6 000倍后，對(duì)精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估的技術(shù)。精子超微結(jié)構(gòu)包括精子頂體、頂體后板層、細(xì)胞核、頸部、尾部和線粒體，其中精子的細(xì)胞核是影響ICSI結(jié)果的主要超微結(jié)構(gòu)。由此在MSOME基礎(chǔ)上出現(xiàn)ICSI 的改良版，即形態(tài)選擇精子胞漿內(nèi)單精子注射(IMSI)。IMSI已被證明是一種有效的技術(shù)，用于某些特定的患者群體的精子選擇。有研究比較了少弱精子癥和畸形精子癥的患者分別采取ICSI和IMSI技術(shù)的妊娠結(jié)局：與ICSI組相比，IMSI組患者的妊娠率和活產(chǎn)率有上升趨勢(shì)，生化妊娠率和著床率也較高[18]。史艷彬等[19]研究顯示，與ICSI相比，IMSI能夠提高優(yōu)胚率，降低胚胎非整倍體率。與ICSI相比，IMSI所選精子的DNA碎片更少且凋亡轉(zhuǎn)錄基因水平更低，IMSI組的胚胎動(dòng)力學(xué)和著床率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率等臨床結(jié)局均要優(yōu)于ICSI組[20]。

其他研究也顯示與ICSI相比，IMSI在不影響胚胎染色體狀態(tài)的前提下，顯著提高了胚胎質(zhì)量和著床率，降低了流產(chǎn)率；由于IMSI在對(duì)精子的選擇過(guò)程中更準(zhǔn)確，所以正常染色體的囊胚形成率高于ICSI。毫無(wú)疑問(wèn)，IMSI技術(shù)的使用可以幫助一些不育夫婦生育孩子，但對(duì)于方法的效率以及如何執(zhí)行IMSI的具體指南尚未達(dá)成共識(shí)。目前，不建議在ART項(xiàng)目中常規(guī)使用IMSI，IMSI僅適用于多次植入失敗的夫婦、嚴(yán)重男性因素致不孕的患者、高齡男性和高齡產(chǎn)婦等人群[21]。而且IMSI的臨床實(shí)踐沒(méi)有足夠的證據(jù)支持，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)闡明其有效性和安全性。

五、透明質(zhì)酸介導(dǎo)的精子選擇

卵母細(xì)胞周圍含有透明質(zhì)酸(HA)，成熟精子在質(zhì)膜和體膜中表達(dá)HA結(jié)合糖蛋白，負(fù)責(zé)結(jié)合和消化HA。HA受體的表達(dá)可作為一種生物標(biāo)志物，用于選擇和分離成熟精子進(jìn)行ART。

基于HA介導(dǎo)的精子選擇技術(shù)有兩種，即生理性胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(PICSI)和富含HA培養(yǎng)基的篩選技術(shù)。PICSI技術(shù)是通過(guò)一個(gè)有HA涂層的培養(yǎng)皿進(jìn)行ICSI；富含HA培養(yǎng)基的篩選技術(shù)是將一滴洗滌過(guò)的精子樣本放置在HA液滴附近，使兩液滴之間有一個(gè)接觸區(qū)，精子會(huì)停留在兩個(gè)液滴的界面，選擇其中結(jié)合了HA的精子進(jìn)行ICSI。研究顯示通過(guò)HA結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的精子，其正常形態(tài)率、獲能2 h酪氨酸磷酸化、誘發(fā)頂體反應(yīng)以及核蛋白成熟度顯著增高，而DNA碎片率顯著降低[22]。在嚴(yán)重畸形精子癥夫婦中，PICSI組的受精情況和胚胎質(zhì)量均顯著優(yōu)于ICSI組[23]。2019年，一對(duì)夫婦使用通過(guò)HA結(jié)合的成熟圓頭形精子進(jìn)行ICSI成功受孕，并成功分娩，嬰兒健康[24]。McDowell等[25]的研究表明，雖然沒(méi)有觀察到不良反應(yīng)，但沒(méi)有足夠的證據(jù)來(lái)驗(yàn)證HA選擇的精子可以改善ART結(jié)果，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估HA為基礎(chǔ)的方法是否可以推薦用于臨床實(shí)踐。

六、磁性活化細(xì)胞分選法

磁活化細(xì)胞分選(MACS)是用磷酯酰絲氨酸與膜聯(lián)蛋白V(annexin-v)包被磁珠，進(jìn)行凋亡與非凋亡精子的選擇。磷脂酰絲氨酸是一種帶負(fù)電荷的磷脂，存在于體細(xì)胞和精子的質(zhì)膜內(nèi)層，在細(xì)胞凋亡早期階段，它被外部化到細(xì)胞外層，與annexin-v結(jié)合。研究表明MACS技術(shù)可以有效地用于清除精子DNA碎片(SDF)較高的精子，MACS組在供卵周期中的妊娠率、自體和卵母細(xì)胞捐獻(xiàn)周期中的活產(chǎn)率均顯著提高，自體ICSI周期中的流產(chǎn)率降低，因此，MACS可能有助于改善ART結(jié)局[26]。有報(bào)道利用MACS技術(shù)從卡塔根氏綜合征患者射出的不動(dòng)精子中優(yōu)選精子，然后通過(guò)ICSI技術(shù)受孕并成功分娩健康嬰兒[27]。

Jeyendran等[4]研究顯示，與PICSI組比較，MACS組患者受精胚胎質(zhì)量、著床率、臨床妊娠和持續(xù)妊娠率等均無(wú)顯著差異；根據(jù)女性年齡進(jìn)行亞組分析時(shí)，年齡<30歲亞組中，MACS組的優(yōu)質(zhì)囊胚率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率均顯著高于PICSI組(P<0.05)，但在30～35歲亞組中，PICSI組擁有較高的植入率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率。但MACS是否有臨床實(shí)踐價(jià)值，以及關(guān)于哪些患者應(yīng)該應(yīng)用仍不確定。

七、電動(dòng)電位法

成熟精子的膜具有-16～-20 mV的電位，這是由精子發(fā)生和附睪成熟過(guò)程中的唾液糖蛋白產(chǎn)生的，這種負(fù)電位可以作為成熟精子的標(biāo)志物。隨著精子獲能，其電位下降，因此成熟的精子可以粘附在帶正電荷物體的表面。電動(dòng)電位法就是基于這一原理，先將精液標(biāo)本用培養(yǎng)基沖洗，再將精子懸液加到新的帶正電荷的玻璃離心管中(離心管置于乳膠手套內(nèi)并旋轉(zhuǎn)2～3次，以獲得正電荷)，為使成熟精子有足夠的時(shí)間粘附于試管壁，將試管室溫靜置1 min，然后離心丟棄不粘附的精子，用含血清的培養(yǎng)基中和試管上的電荷，獲得成熟的精子。也可以使用商業(yè)化電動(dòng)電位分析儀，通過(guò)施加電場(chǎng)，具有電荷的精子將向電極遷移，它們移動(dòng)的速度與場(chǎng)強(qiáng)和電勢(shì)成正比。常規(guī)ICSI中精子選擇是基于形態(tài)和活力，這并不一定排除將DNA受損或凋亡的精子注射到卵母細(xì)胞中，電動(dòng)電位法可以盡可能避免這一缺陷。

電動(dòng)電位法和密度梯度離心法(DGC)回收的精子進(jìn)行比較，兩種方法得到的精子的相對(duì)端粒長(zhǎng)度和絕對(duì)端粒長(zhǎng)度均無(wú)顯著性差異，但電動(dòng)電位法制備的精子的平均DNA碎片率顯著低于DGC法[28]。DGC法和電動(dòng)電位法的結(jié)合可以選擇磷酯酶Cζ(PLCζ)較高百分比的精子群體，這些精子包含大量的PLCζ并且染色質(zhì)完整，這種精子選擇程序可以為以前受精失敗的不育男性開(kāi)辟一種新的途徑[29]。與傳統(tǒng)DGC法相比，電動(dòng)電位法不僅提高了胚胎質(zhì)量，而且改善了妊娠結(jié)局；盡管電動(dòng)電位法選擇后的X/Y比例相近，但電動(dòng)電位組的出生性別比(XY/XX)顯著低于DGC組[30]。此外，電動(dòng)電位法回收率低，導(dǎo)致其在少精子癥或睪丸穿刺精子回收的情況下使用有限[31]。

電動(dòng)電位法的主要優(yōu)點(diǎn)在于它的簡(jiǎn)便和廉價(jià)，所選擇的精子DNA片段較少、形態(tài)正常、活力和運(yùn)動(dòng)性好。但仍需要更多的研究來(lái)闡明電動(dòng)電位法是否改變了新生兒性別比例。

八、電泳法選擇精子

與電動(dòng)電位法相似，電泳法選擇精子也是基于成熟精子的質(zhì)膜帶負(fù)電荷。電泳法是將精液樣本置于電泳裝置中，然后施加電壓選擇帶負(fù)電荷的精子。電泳選擇精子技術(shù)可以根據(jù)精子的大小和負(fù)電荷，從未成熟、功能失調(diào)的生殖細(xì)胞和白細(xì)胞中分離出精子。該裝置包括兩個(gè)內(nèi)室，用于精子的接種；兩個(gè)外室，用于收集選定的精子；兩個(gè)電極和兩個(gè)緩沖泵。內(nèi)、外室由聚碳酸酯膜隔開(kāi)，成熟的精子可以穿過(guò)，而較大的細(xì)胞被阻擋，這樣就可以獲取存活、活動(dòng)、形態(tài)正常以及DNA損傷程度較低的精子。該方法適用于嚴(yán)重少、弱精子癥以及睪丸穿刺精子等的精子選擇。

電泳分離的精子活力和形態(tài)均優(yōu)于Percoll梯度離心精子，生成的活性氧(ROS)更少，而且在睪丸或附睪穿刺精子中顯示出更低水平DNA損傷[32]。在對(duì)精子處理分析時(shí)，電泳法獲取的精子DNA損傷率低于DGC，獲取的精子質(zhì)量與受精率、植入率和和囊胚發(fā)育呈正相關(guān)；而且有通過(guò)電泳法獲取高質(zhì)量的精子受精后成功分娩的報(bào)道[33-34]。鑒于電動(dòng)電位法對(duì)性別比例有一定的影響，Ainsworth等[35]也對(duì)電泳法的性別比例進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示電泳方法處理的精液，并沒(méi)有導(dǎo)致攜帶X或Y的精子的比例發(fā)生顯著變化。但有一些證據(jù)表明電泳法對(duì)精子活力存在負(fù)面影響，且使用電泳可能會(huì)引起一些安全問(wèn)題[4]，故仍需要更多的研究來(lái)確定該方法在臨床實(shí)踐中的有效性。

九、精子的微流體分離

微流體是一種基于受控環(huán)境中亞微升水平上流體行為的物理和化學(xué)原理的新技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)用于遺傳學(xué)到ART技術(shù)的多個(gè)領(lǐng)域。微流體在精子選擇中的潛在效用已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，研究顯示該技術(shù)從混合細(xì)胞懸浮液中回收精子的回收率>96%，大大提高穿刺取出精子的恢復(fù)時(shí)間，從人工觀察的幾個(gè)小時(shí)恢復(fù)提高到自動(dòng)精子恢復(fù)的幾分鐘，處理時(shí)間提高了36倍；此外，精子微流處理對(duì)精子參數(shù)如精子的活力、形態(tài)以及DNA碎片沒(méi)有顯著影響；將微流體用于不動(dòng)精子獲取可以極大地改進(jìn)目前的睪丸精子提取的處理程序，簡(jiǎn)化操作流程，從而保證手術(shù)成功[36]。微流體精子處理提供了一種替代傳統(tǒng)精子分離的技術(shù)，可以從未處理的樣品中分離出前向運(yùn)動(dòng)的精子，雖然通過(guò)微流體的處理會(huì)降低精子濃度，但改善了精子的運(yùn)動(dòng)性和活力以及降低精子DNA碎片率(DFI)水平，反映了該技術(shù)的高度選擇性[37]。

通過(guò)對(duì)微流體和直接上游法獲取的精子分別進(jìn)行ICSI的移植結(jié)局比較，發(fā)現(xiàn)微流體獲得的精子受精后優(yōu)質(zhì)胚胎率較高，植入率以及臨床妊娠率均高于直接上游法[38]。Yetkinel等[39]顯示微流體系統(tǒng)的使用改善了胚胎質(zhì)量，但與傳統(tǒng)的精子上游法相比，受精率、臨床妊娠率以及活產(chǎn)率并沒(méi)有顯著差異。需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估微流體的潛力及其在ART中的臨床應(yīng)用。目前，這項(xiàng)技術(shù)大多以研究為主要目的，臨床應(yīng)用的適用性較低。

十、總結(jié)

基于新的數(shù)據(jù)和對(duì)人類精子的更深理解，先進(jìn)的精子選擇方法慢慢被開(kāi)發(fā)出來(lái)，各種新技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)及適應(yīng)證(表1)。新技術(shù)需要超越傳統(tǒng)精子選擇方法，解決更復(fù)雜的情況。盡管使用這些先進(jìn)的精子選擇方法已經(jīng)被證明可以改善ART結(jié)局，但大多數(shù)研究仍處于胚胎層面，隨后的發(fā)育和臨床結(jié)局需要進(jìn)一步研究，以驗(yàn)證其在臨床實(shí)踐中的有效性。

表1 精子優(yōu)選方法的適應(yīng)癥及優(yōu)缺點(diǎn)