寧安鳳，肖南松，王瑚，管純一，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

全氟辛烷磺?；衔?perfluorooctane sulfonate，PFOS)作為全氟化合物(perfluorocarbons，PFCs)的典型代表，生產(chǎn)及使用時(shí)間已超過50 年，常在服飾、電子、機(jī)械等領(lǐng)域被用作防水防火等阻燃材料[1-2]。但由于其毒性持久并具有高度生物累積性導(dǎo)致人體已被檢測出全氟化合物的存在，最高約達(dá)10-6mol/L[3-4]，并很有可能因此對人類健康造成威脅。因此，2009年P(guān)FOS就已被斯德哥爾摩公約成員國列入持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)名單中被禁用。

在歐盟高關(guān)注度物質(zhì)(REACH)化學(xué)品注冊系統(tǒng)評估方法等認(rèn)定中，全氟丁基磺酸鉀(PFBSK)雖亦具有含氟表面活性劑的一般性質(zhì)，但由于氟碳鏈短(圖1)和生物蓄積性不高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于聚碳酸酯(PC)的阻燃劑。但近期發(fā)現(xiàn)，PFBSK具有高度持久可流動性并且可能具有生物毒性，在2020 年初被歐洲化學(xué)品管理局(ECHA)添加到REACH候選物質(zhì)清單中。

圖1 PFOS(左)與PFBSK(右)化學(xué)結(jié)構(gòu)式

胚胎作為生物個體起始階段其發(fā)育失?？赡軐?dǎo)致機(jī)體未來永久性的結(jié)構(gòu)與功能異常，因此目前在胚胎早期就進(jìn)行產(chǎn)前診斷。饒群等[5]研究發(fā)現(xiàn)，囊胚形態(tài)對非整倍體周期的植入前基因檢測具有一定意義。有文獻(xiàn)報(bào)道，PFOS急性毒性試驗(yàn)會引起斑馬魚胚胎發(fā)育形態(tài)異常、胚胎死亡率加劇及多種生理指標(biāo)下調(diào)[6]。而PFBSK與PFOS具有一定相似性，尤其在高度持久性方面[7]，但PFBSK是否同樣具有生物胚胎毒性尚未得知。

本實(shí)驗(yàn)選取具有代表性的哺乳動物小鼠作為研究對象，通過開展PFBSK急性毒性試驗(yàn)觀察PFBSK是否對哺乳動物植入前胚胎發(fā)育造成一定影響。

資料與方法

一、研究對象

ICR品系健康小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，雄性10～12周齡小鼠8只，雌性6～8周齡小鼠80只。所有小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物室，動物室溫度約為25℃、相對濕度約為50%，噪聲保持在60 dB以下。

二、研究方法

1.主要試劑：體外操作液、受精培養(yǎng)基、卵裂培養(yǎng)基、囊胚培養(yǎng)基、血清白蛋白(HSA)均購至美國Sage In-Vitro Fertilization公司；活性氧檢測試劑盒(上海碧云天)；凋亡檢測試劑盒(廣州銳博生物)；注射用血促性素(PMSG)和注射用絨促性素(HCG)購至寧波三生生物；98% PFBSK(Sigma-Aldrich，美國)。

3.體外受精操作準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)前1天將受精培養(yǎng)基預(yù)平衡。在受精培養(yǎng)基中添加5%HSA，隨后使用移液器在培養(yǎng)皿中制作約15個50 μl液滴，覆蓋礦物油，于37℃、5%CO2、95%空氣及100%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)平衡過夜。

6.受精卵卵裂與囊胚形成：將已培養(yǎng)5 h的受精卵換液至提前預(yù)平衡2 h以上含5% HSA的卵裂培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，移入卵裂培養(yǎng)基前應(yīng)先將受精培養(yǎng)基清洗干凈；待72 h后，將卵裂培養(yǎng)基中的桑椹胚移入平衡2 h以上含5% HSA的囊胚培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h至形成囊胚，移入前也將卵裂培養(yǎng)基洗凈。

7.早期胚胎急性暴露PFBSK方式：精子與卵母細(xì)胞受精完成后，將約30顆受精卵設(shè)為一組，置于含有不同濃度[0 mol/L(對照組)、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L及10-6mol/L]PFBSK的卵裂培養(yǎng)基中培養(yǎng)；72 h后移入各個相應(yīng)PFBSK濃度的囊胚培養(yǎng)基中。在植入前胚胎體外培養(yǎng)過程中，統(tǒng)計(jì)對照組與各實(shí)驗(yàn)組的1-細(xì)胞數(shù)(受精卵，0 h)、2-細(xì)胞數(shù)(24 h)、≥4-細(xì)胞數(shù)(48 h)、桑椹胚數(shù)(72 h)及囊胚數(shù)(96 h)，并以1-細(xì)胞數(shù)為總數(shù)，計(jì)算其余時(shí)期胚胎的發(fā)育率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析。

8.活性氧水平檢測：利用活性氧檢測試劑盒內(nèi)的熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后會形成DCF發(fā)出熒光信號，繼而用共聚焦顯微鏡檢測DCF熒光信號強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm，綠色熒光)，并利用Image J計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，以此代表活性氧水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析。

9.凋亡水平檢測：凋亡檢測試劑盒采用TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)方法。經(jīng)TDT酶催化作用，在DNA的3’-羥基末端催化參入florescein-dUTP發(fā)出熒光信號，使用共聚焦顯微鏡檢測熒光信號強(qiáng)度(激發(fā)波長560 nm，紅色熒光)，并利用Image J計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，以此代表凋亡水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism9.0軟件中t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行單因素方差分析。數(shù)據(jù)以百分率(%)或平均熒光強(qiáng)度(AU)進(jìn)行表示，利用方差分析數(shù)據(jù)之間的組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高劑量的PFBSK急性暴露對小鼠受精卵植入前胚胎發(fā)育的影響

本實(shí)驗(yàn)從受精卵培養(yǎng)于PFBSK處理過的培養(yǎng)基中開始統(tǒng)計(jì)，記為1-細(xì)胞數(shù)，并以此為總數(shù)，統(tǒng)計(jì)各個時(shí)期的發(fā)育率。結(jié)果顯示，與對照組相比，PFBSK 10-4mol/L組、PFBSK 10-5mol/L組和PFBSK 10-6mol/L組的2-細(xì)胞率、≥4-細(xì)胞率、桑椹胚率及囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)，并且胚胎發(fā)育形態(tài)良好，未見異常；而PFBSK 10-3mol/L組的囊胚率與對照組相比顯著下降(P<0.05)，且在囊胚時(shí)期觀察形態(tài)發(fā)現(xiàn)，該組有部分胚胎停滯于桑椹胚，延長發(fā)育時(shí)期也無法使其生長至囊胚(表1，圖2)。

表1 PFBSK藥物處理組和對照組植入前胚胎發(fā)育率的比較[n(%)]

圖2 PFBSK藥物處理組和對照組植入前胚胎發(fā)育形態(tài)觀察(×100)

二、高劑量PFBSK急性暴露對小鼠植入前胚胎活性氧水平的影響

胚胎發(fā)育率結(jié)果提示，當(dāng)PFBSK達(dá)10-3mol/L時(shí)會對胚胎造成損傷。為研究損傷機(jī)制，選取PFBSK 10-3mol/L組與對照組發(fā)育96 h至囊胚時(shí)期的胚胎，進(jìn)行活性氧水平比較。結(jié)果顯示，PFBSK 10-3mol/L組平均熒光強(qiáng)度顯著高于對照組(P<0.05)(圖3)。此結(jié)果說明過量的活性氧可能是由于高劑量PFBSK急性暴露引起的氧化還原失衡所導(dǎo)致，而最終造成了囊胚異常發(fā)育。

A：共聚焦顯微鏡熒光圖(×400)；B：平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。組間比較，*P<0.05。圖3 10-3 mol/L PFBSK組和對照組活性氧水平的比較

三、高劑量PFBSK急性暴露對小鼠植入前胚胎凋亡水平的影響

為研究是否由活性氧堆積觸發(fā)凋亡通路引起早期胚胎損傷，我們進(jìn)行了TUNEL實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，培養(yǎng)96 h后，PFBSK 10-3mol/L組囊胚時(shí)期胚胎雖出現(xiàn)了發(fā)育率下降現(xiàn)象，但與對照組相比，PFBSK 10-3mol/L組的胚胎細(xì)胞凋亡平均熒光強(qiáng)度無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

A：共聚焦顯微鏡熒光圖(×400)；B：平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。圖4 10-3 mol/L PFBSK組和對照組凋亡水平的比較

討 論

隨著新興技術(shù)的蓬勃發(fā)展，大量的化學(xué)物質(zhì)被廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域，極大滿足了人們?nèi)粘Ｐ枨?，但由于長期接觸類化合物后發(fā)現(xiàn)此類物質(zhì)可能對人體產(chǎn)生不可逆損傷，因此外源性化學(xué)物質(zhì)毒性研究日益受到重視。此外，在一些研究調(diào)查中，研究者憑借胚胎對環(huán)境敏感性，常利用胚胎檢測環(huán)境中是否存在有害物質(zhì)，以此對自然與社會環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化[8]。因此，無論從何種角度來說，研究外源化學(xué)物質(zhì)對胚胎造成損傷是十分必要的。

在工業(yè)使用及加工制品當(dāng)中，PFBSK作為添加劑應(yīng)用于各個領(lǐng)域，如電鍍、紡織、皮革、造紙、消防、選礦等行業(yè)。根據(jù)用途不同，PFBSK釋放量也有所不同，其中紡織、皮革、消防所占比重最大。國內(nèi)有學(xué)者在2006至2008 年間，選取10座發(fā)展迅速城市檢測了自來水中PFBSK含量，其中最高為18 ng/L[9]。而結(jié)合其他調(diào)查[10-13]，通過估算全國范圍內(nèi)水體PFBSK含量約為49.6 ng/L。盡管根據(jù)經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)采用的檢測方法觀察到PFBSK 的生態(tài)毒性危害和風(fēng)險(xiǎn)均低于 PFOS，但目前并沒有研究證明PFBSK不會導(dǎo)致人體急慢性中毒。胚胎毒性在PFCs家族中存在較為普遍，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道除PFOS外，全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid，PFOA)也具有明顯的胚胎毒性，小鼠妊娠期急性暴露PFOA會降低產(chǎn)仔數(shù)并使生殖系統(tǒng)發(fā)育不良[14]。因此，不難讓人懷疑PFBSK作為替代品是否同樣具有胚胎毒性。

本實(shí)驗(yàn)研究對象選擇受精卵時(shí)期胚胎，通過高劑量急性暴露PFBSK建立損傷模型，統(tǒng)計(jì)植入前各個時(shí)期胚胎發(fā)育率與對照組差異以及胚胎細(xì)胞內(nèi)活性氧和凋亡水平進(jìn)行檢測，來判斷PFBSK是否具有胚胎毒性及以何種途徑體現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，劑量在10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L PFBSK的外源性急性暴露并未引起植入前胚胎發(fā)育率下降，但在10-3mol/L PFBSK急性暴露下會影響胚胎細(xì)胞的囊胚率(P<0.05)，說明PFBSK存在著潛在的胚胎毒性；之后我們應(yīng)用DCHF-DA探針進(jìn)行胚胎細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測，發(fā)現(xiàn)10-3mol/L的PFBSK急性暴露96 h后，活性氧的水平顯著高于對照組；既然外源性急性暴露PFBSK會引起新陳代謝異常產(chǎn)生大量活性氧，那么該行為可能會使早期胚胎誘發(fā)線粒體損傷。線粒體損傷嚴(yán)重可能引起細(xì)胞自主凋亡，為檢測損傷是否直接引起早期胚胎走向凋亡途徑，我們又應(yīng)用florescein-dUTP探針進(jìn)行檢測凋亡水平。但在凋亡水平檢測中并沒有發(fā)現(xiàn)對照組與10-3mol/L PFBSK之間存在顯著性差異。在毒性領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)中，有PFCs成員暴露引起活性氧積累的氧化應(yīng)激損傷案例[15]?；钚匝踝鳛榈诙攀沟囊环N，因在植入前胚胎發(fā)育時(shí)期參與胞質(zhì)成熟細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所以如若發(fā)生活性氧動態(tài)平衡失調(diào)極易誘發(fā)線粒體功能障礙引起胚胎損傷，例如出現(xiàn)植入前胚胎發(fā)育阻滯及死亡現(xiàn)象[16]。但由PFBSK急性暴露引起的堆積活性氧并未引起胚胎發(fā)育阻滯，現(xiàn)象僅為囊胚率異常，并且細(xì)胞凋亡水平也并未發(fā)現(xiàn)異常，所以PFBSK急性暴露可能并未引起自主有序死亡途徑激活?；钚匝醍惓Ｉ呖赡軐?dǎo)致多種途徑發(fā)生改變，例如，高活性氧可能通過妨礙發(fā)育時(shí)期磷酸化作用和去磷酸化作用錯誤調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，或使去乙?；覆荒苷＿\(yùn)轉(zhuǎn)從而導(dǎo)致對植入前胚胎發(fā)育造成一定的負(fù)面影響[17-18]。

本文根據(jù)統(tǒng)計(jì)植入前胚胎發(fā)育率和檢測生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)高劑量PFBSK急性暴露可能通過氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致早期發(fā)育胚胎產(chǎn)生潛在的毒性，但對于揭示PFBSK對哺乳動物植入前胚胎發(fā)育影響的目標(biāo)而言，尚需進(jìn)一步的深入探討。在進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)中應(yīng)利用更為充分的檢測方法評價(jià)微細(xì)結(jié)構(gòu)和功能變化來驗(yàn)證PFBSK的胚胎毒性，并探究通過何種機(jī)制導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育受阻，從而為PFBSK的調(diào)查與評估提供理論支持并向安全使用新型材料提供科學(xué)依據(jù)。