張培東 梁華悅 黃泫茜 謝海 莫實德 勞飛翔 梁冰玉*

1 防城港市疾病預(yù)防控制中心，廣西防城港市 538021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院&廣西艾滋病防治研究重點實驗室，南寧市 530021

近年來，全球獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)流行情況越發(fā)嚴(yán)峻。多種HIV毒株在同一地區(qū)流行時，HIV復(fù)制過程中發(fā)生的突變以及病毒之間的基因重組都會增加HIV-1基因型的遺傳多樣性和復(fù)雜性。重組病毒在至少3例及以上無流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的個體流行，即可鑒定為一種新流行重組型(circulating recombinant form, CRF) HIV毒株[1]。現(xiàn)在，全球已有118 種流行重組亞型(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html)。2015年全國第四次HIV分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，4種優(yōu)勢HIV-1 CRF占所有HIV毒株的89.3%，分別是CRF07-BC(41.3%)，CRF01-AE(32.7%)，CRF08-BC(11.3%)和B亞型(4.0%)[2]。廣西主要流行的優(yōu)勢HIV 毒株是CRF01-AE，其次是CRF07-BC和CRF08-BC，且有多種新型的重組毒株流行，例如CRF-59-01B、CRF55-01B[3-5]。在多種毒株共同流行的背景下，近年來廣西陸續(xù)出現(xiàn)許多新的CRF和獨特重組型(unique recombinant form, URF)，包括CRF01-AE/CRF08-BC、CRF01-AE/CRF07-BC、CRF01-AE/CRF07-BC/CRF08-BC[6-9]，但尚無含 3種或3種以上基因亞型的新型CRF的研究報道。本研究檢測分析發(fā)現(xiàn)一種新的CRF65-cpx重組體(B/C/CRF01-AE)，是廣西地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜重組毒株，通過對其每個重組片段進(jìn)行序列和進(jìn)化分析，探討其重組形式的產(chǎn)生與境外、境內(nèi)毒株的關(guān)聯(lián)，以及此重組型在廣西地區(qū)是否有散發(fā)流行的可能性，可為開展HIV防治工作提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究病例為男性患者，來自中國(廣西)越南邊境某市，45歲，因異性性行為感染HIV，患者血清樣本編號為BFC92。

1.2 HIV-1 RNA提取 采用RNA病毒提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit (德國QIAGEN)、離心柱吸附法提取血清樣本HIV-1 RNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 HIV-1基因擴(kuò)增、純化和測序 分兩輪擴(kuò)增病毒RNA。第一輪采用 SuperScript Ⅲ First-stand Synthetic System transcriptase試劑盒(美國Invitrogen)將HIV-1 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為25 μL。第二輪以cDNA為模板，采用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 試劑盒(美國Invitrogen)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)熱2 min；94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 4 min，進(jìn)行35個循環(huán)，終延伸68 ℃ 10 min，8 ℃保存。兩輪PCR擴(kuò)增后所得PCR產(chǎn)物為近似全長基因組。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切割PCR產(chǎn)物條帶回收，其純化和測序委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行。PCR擴(kuò)增引物及測序引物參照文獻(xiàn)[10]。

1.4 近似全長基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 采用 Los Alamos HIV Sequence Database 的在線工具HIV Align對序列進(jìn)行剪切校正，再用 BioEdit 軟件進(jìn)行手工校對。從Los Alamos HIV Sequence Database(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)中下載HIV-1各亞型參考序列，采用 MEGA-X軟件、neighbour-joining法、Kimura two-parameter模型構(gòu)建近似全長基因系統(tǒng)進(jìn)化樹， Bootstrap Replications設(shè)置為1 000次，當(dāng)分支節(jié)點自展值(Bootstrap值)大于0.7時，認(rèn)為該節(jié)點置信度較高。

1.5 重組序列斷點分析 將得到的近似全長基因序列提交到在線分析軟件HIV-1 Sequence Quality Analysis(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QC/index.html)，以 HXB2 為標(biāo)準(zhǔn)參考株，排除序列組裝錯誤后，采用Los Alamos HIV Sequence Database 的在線工具jpHMM模型(jumping profile Hidden Markov Model)(http://jphmm.gobics.de/)進(jìn)行重組序列斷點分析，并利用Los Alamos HIV Database在線工具Recombinant HIV-1 Drawing Tool(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/DRAW_CRF/recom_mapper.html)生成基因序列圖；進(jìn)一步采用MEGA-X軟件構(gòu)建(修飾)亞基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 耐藥分析 將比對整齊的fasta序列文件上傳至斯坦福大學(xué)耐藥數(shù)據(jù)庫(https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences/)，利用HIV dbProgram模塊按照第9.0版本的基因型抗性解釋算法篩選出序列中存在的耐藥突變位點。

2 結(jié) 果

2.1 近似全長基因系統(tǒng)進(jìn)化樹和耐藥分析 測序結(jié)果顯示，序列全長為8900 bp，是以C為骨架，插入CRF01-AE和B亞型片段的流行重組毒株。將本研究獲得序列與國內(nèi)報道的5條CRF65-cpx參考序列[11-12]進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示6條序列可聚合構(gòu)成為一個單系聚類，Bootstrap值為95%，提示該毒株是由 CRF01-AE、B及C組成的CRF65-cpx重組亞型(B/C/CRF01-AE)毒株。見圖1。耐藥分析結(jié)果顯示，該毒株存在V179D突變，耐藥評分10分，對EFV、ETR、NVP、RPV藥物敏感。

圖1 樣本BFC92毒株的近似全長基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 重組序列斷點分析 重組序列斷點分析結(jié)果顯示，該序列由14個片段重組而成(見圖2A)。參照HIV-1標(biāo)準(zhǔn)毒株HXB2，該毒株的序列位置為790～9412bp，從5′至3′端涵蓋了病毒所有的調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因，分別為gag、pol、vif、vpr、tat、vpu、env、rev和nef，是較為完整的基因序列，見圖2B。

圖2 樣本BFC92毒株的重組序列斷點分析

2.3 分段基因序列進(jìn)化樹分析 樣本BFC92毒株近全長基因序列由 CRF01-AE、CRF01-B 和 CRF01-C 組成，序列位置為790～9412bp，含14個片段，其13個斷點位置為1170、3803、4015、5655、5830、5993、6378、7586、8349、8506、8568、8830和8995，片段Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅻ為CRF01-AE亞型，片段Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ和ⅩⅢ為B亞型，片段Ⅱ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅺ和ⅪⅤ為C亞型。對14個重組片段分別構(gòu)建亞區(qū)域基因進(jìn)化樹(見圖3)，分析斷點位置的置信度，片段Ⅰ(所在區(qū)段HXB2：790-1169bp)、Ⅴ(5655-5829)、Ⅶ(5993-6377)、Ⅹ(8349-8505)和Ⅻ(8568-8829)與 CRF01_AE 聚集成簇，其Boostrap 值分別為99%、94%、99%、80%和100%。片段Ⅲ(3803-4014)、Ⅵ(5830-5992)、Ⅸ(7585-8348)和ⅩⅢ(8830-8994)與B聚集，Boostrap 值分別為83%、84%、70%和89%。片段Ⅱ(1170-3802)、Ⅳ(4015-5654)、Ⅷ(6378-7585)、Ⅺ(8506-8567)和ⅪⅤ(8995-9412)與C聚集，Boostrap 值分別為100%、99%、98%、82%和99%。

圖3 樣本BFC92毒株近似全長基因序列14段片段的亞型分析進(jìn)化樹

3 討 論

HIV-1重組株是重復(fù)感染或合并感染多種亞型形成的[1]。2013年，CRF65-cpx毒株在中國云南異性性傳播人群中被檢出，這是在中國發(fā)現(xiàn)的一種流行HIV重組亞型[11]。既往研究結(jié)果顯示，CRF65-cpx毒株大約在2000年(1997～2003年)起源于云南省，并于2007年(2005～2008年)傳入北京市和安徽省的同性戀人群[13-14]。研究結(jié)果表明，CRF65-cpx重組毒株主要在同性戀人群中流行傳播，而在云南主要是在異性人群中傳播[15-16]。本研究結(jié)果顯示，在廣西異性接觸感染HIV-1的患者中鑒定出CRF65-cpx重組體(B/C/CRF01-AE)。

本研究中的HIV-1感染患者具有云南服役史，因異性性傳播而感染，推測該患者是在云南服役期間感染此毒株。廣西與云南相鄰，CRF65-cpx毒株很容易從云南傳入廣西。本研究結(jié)果顯示，重組毒株(B/C/ CRF01-AE)的B亞型基因片段(Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ和ⅩⅢ)與泰國B亞型毒株存在聚類，CRF01-AE亞型插入片段(Ⅰ、Ⅴ、Ⅹ和Ⅻ)與越南北部IDU流行的CRF01-AE毒株聚類[17-18]；該重組毒株(B/C/CRF01-AE)與在云南異性人群中首次發(fā)現(xiàn)的CRF65-cpx毒株具有很高的同源性。

既往研究結(jié)果顯示，CRF01-AE和B亞型耐藥相關(guān)位點的突變頻率較高，毒株中V179D/E突變發(fā)生頻率為11.06%(6.24%～17.00%)，偶見于使用依非韋倫(EFV)治療的HIV感染患者[19]。Liu等[20]報道，在我國7個省流行的CRF65-cpx毒株存在V179D突變。毒株發(fā)生V179D/E突變會導(dǎo)致未接受抗病毒治療的HIV感染患者對非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)藥物的敏感性降低。本研究結(jié)果顯示，重組毒株(B/C/CRF01-AE)存在V179D突變，可判定為潛在耐藥[19,21-23]，因此對攜帶CRF65-cpx毒株HIV感染患者的臨床治療具有一定的挑戰(zhàn)性，需要加強對患者病毒載量和耐藥的監(jiān)測。

綜上所述，在廣西邊境某市發(fā)現(xiàn)的CRF65-cpx病毒株是由B、C和 CRF01-AE亞型毒株重組而成，且含有V179D突變。廣西邊境地區(qū)應(yīng)加強對該亞型或類似新型病毒株的監(jiān)測并采取相應(yīng)的預(yù)防控制措施，以防止境外新型重組毒株或本地重組毒株在該地區(qū)的擴(kuò)散傳播流行。