劉俊紅，林青青，劉瑞芳，張苗玉，王錕宇

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036；2.中國礦業(yè)大學(xué) 電力與動力工程學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

膳食纖維(Dietary Fiber，DF)是一種多糖，不能被腸道吸收，也不提供能量。研究表明，膳食纖維具有預(yù)防便秘和結(jié)腸癌，降低血糖，預(yù)防糖尿病，降低血清膽固醇，預(yù)防冠狀動脈硬化等功能[1-3]。將膳食纖維作為食品添加劑添加到飲料中，可改善飲料的口感，例如可口可樂、雪碧等碳酸飲料都推出了“纖維+”等產(chǎn)品，滿足了功能性食品的需求，成為當(dāng)前飲料加工的一個新的發(fā)展方向[4]。

葡萄作為我國大宗消費水果，除了鮮食還可生產(chǎn)出各種深加工產(chǎn)品，在加工過程中產(chǎn)生的葡萄皮渣大部分都用作肥料，利用率低[5-8]。提取葡萄皮渣中的可溶性膳食纖維的方法很多，如酸法、活性酶法、發(fā)酵法等[9-11]?；瘜W(xué)法操作方便但副產(chǎn)物多，影響提取物的含量，同時污染環(huán)境[9]；酶法雖然污染小，但成本投入高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)[12]；發(fā)酵法污染小、產(chǎn)率高，制得的膳食纖維色澤、質(zhì)地、氣味、分散程度、持水力和得率均優(yōu)于化學(xué)法[13-14]。雖然酶法、膜過濾和發(fā)酵法提取膳食纖維的技術(shù)尚不成熟，但反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境的污染相對較小[15]。

目前，國內(nèi)外提取膳食纖維以化學(xué)法為主，研究膳食纖維起步較早的國家，都在積極探索采用較為溫和的工藝方法提取分離膳食纖維[16-18]。

本文以葡萄皮渣為原料，可溶性膳食纖維(SDF)的得率為指標(biāo)，探究發(fā)酵法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的工藝條件，為葡萄皮渣的綜合利用提供依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

葡萄皮渣：平頂山市德秀葡萄酒廠生產(chǎn)葡萄酒后的葡萄皮渣，干燥粉碎過60目篩備用。

1.2 主要試劑

95%乙醇(分析純)：洛陽化工廠；氫氧化鈉(分析純)：西隴化工股份有限公司；保加利亞乳桿菌(CICC6045)：廣東省微生物菌種保藏中心；嗜熱鏈球菌(IFFI6038)：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.3 主要試驗儀器

ME204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；MJ-78A高壓滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；DHG-9123A鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DC-1044低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：安徽予華儀器設(shè)備有限公司。

1.4 試驗方法

將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌凍干粉活化后擴(kuò)大培養(yǎng)，接種到葡萄皮渣粉配制的培養(yǎng)基中。利用微生物發(fā)酵的特點，使葡萄皮渣中的糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等消耗，因這兩種菌無法消耗降解纖維素，故可制得膳食纖維。

將2 g粉碎過篩的葡萄皮渣按照一定的料液比混合，加入2%脫脂奶粉、1.5%白砂糖并調(diào)至合適的pH值，接種發(fā)酵，分析發(fā)酵時間、pH、菌種接種量、料液比對試驗結(jié)果的影響，每個單因素做五個梯度，三組平行。

1.4.1 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

本試驗用的菌種是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌[19]。

(1)保加利亞乳桿菌的活化

利用滅菌的MRS培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h。首次活化，干粉用盡量少的復(fù)水液溶解。

(2)嗜熱乳酸鏈球菌的活化

采用滅菌的10%脫脂牛奶培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。凍干粉首次活化時，干粉用盡量少的MRS培養(yǎng)液溶解。

(3)擴(kuò)大培養(yǎng)基：10%的脫脂牛奶培養(yǎng)基

1.4.2 單因素試驗

(1)菌種接種量對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

② 冷卻至室溫后分別接入菌種3.0%，混勻封口后放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。

③ 培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，取濾液，放入3倍體積78%乙醇后攪勻靜置3 h，置于低溫高速離心機(jī)中，室溫下4 000 r/min離心10 min。所得沉淀55 ℃干燥至恒重后，記錄試驗結(jié)果即為SDF質(zhì)量。

④ 依次將菌種接種量改為2.0%、2.5%、3.5%、4.0%，重復(fù)①～③的操作。

(2)pH對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

依次將pH改為6.2、6.4、6.7、7.0、7.2，重復(fù)1.4.2(1)的試驗。

(3)料液比對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

(4)發(fā)酵時間對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

依次將發(fā)酵時間改為16 h、18 h、20 h、22 h、24 h，重復(fù)1.4.2(1)的試驗。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗，探索發(fā)酵法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的最佳工藝[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 菌種接種量對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

不同接種量對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響見圖1。

由圖1可知，SDF得率先增高后緩慢降低，接種量在3.0%時葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的得率最高。在菌種接種量為2.0%～2.5%時，可溶性膳食纖維的得率緩慢升高，說明接種量小的時候不能充分降解葡萄皮渣中的糖類、脂類、蛋白質(zhì)等，在抽濾的時候部分生物大分子沒有被抽濾下來；隨著菌種接種量的增大，即接種量在2.5%～3.0%之間時，葡萄皮渣中的營養(yǎng)成分逐漸被菌種降解吸收，因此葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的得率快速上升；在菌種接種量為3.0%時，SDF的得率最高，達(dá)到22.5%；當(dāng)接種量在3.0%～4.0%時，SDF得率緩慢降低，變化趨于平緩，說明在既定的發(fā)酵液中，含量恒定的營養(yǎng)物質(zhì)在較高的接種量下被降解殆盡，葡萄皮渣中的可溶性膳食纖維得率變化不顯著。

2.1.2 pH對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

pH對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響見圖2。

圖1 接種量對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

圖2 pH對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

由圖2可以看出，葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率先升高后降低，曲線的轉(zhuǎn)折點在pH為6.4時，葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率最高。在pH為6.2～6.4時，葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率顯著升高，pH為6.4時達(dá)到最大，說明此時的pH適合菌體的生長，各種酶的活性處于最高狀態(tài)，對底物的消耗較為徹底，培養(yǎng)基中的可利用成分幾近耗盡；在pH為6.4～7.2時，葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率逐漸下降，在pH為6.7后下降明顯，說明pH過高，參與代謝反應(yīng)的酶的活性受到抑制，酶促反應(yīng)速率減緩，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分降解率偏低，降低了葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的得率。

2.1.3 料液比對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

料液比對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響見圖3。

由圖3可知，料液比的增加使得葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率先升高后降低，料液比18時可溶性膳食纖維得率最高。

2.1.4 發(fā)酵時間對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

發(fā)酵時間對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響見圖4。

圖3 料液比對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

圖4 發(fā)酵時間對葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，可溶性膳食纖維的得率先增高后降低，20 h時達(dá)到最大，隨后產(chǎn)物得率下降。發(fā)酵時間在16 h～20 h時，隨著發(fā)酵時間的延長，菌種生長由延滯期進(jìn)入對數(shù)期，比生長速率以指數(shù)級數(shù)增加，對底物的降解程度快速增加，表現(xiàn)為產(chǎn)物得率的持續(xù)上升；當(dāng)發(fā)酵20 h時，底物的降解速率達(dá)到最大，此時產(chǎn)物得率最高；隨著發(fā)酵時間的延長，經(jīng)過對數(shù)期后，菌種的比生長速率趨于平緩，對底物的消耗速率下降；尤其是進(jìn)入衰亡期后，菌種死亡速率增加，對底物的消耗程度下降，產(chǎn)物得率隨之下降。

2.2 正交試驗

在菌種接種量、pH、料液比、發(fā)酵時間四個單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定菌種接種量3.0%、pH為6.4、料液比18、發(fā)酵時間20 h的基礎(chǔ)上，使用正交軟件設(shè)計正交試驗，因素水平表和試驗安排見表1和表2。

表1 正交試驗設(shè)計的因素及水平

表2 正交試驗安排與結(jié)果

續(xù)表2

由表2可知，影響試驗結(jié)果的最敏感因素是pH，其次是料液比，在試驗操作過程中應(yīng)嚴(yán)格控制。

表2的試驗結(jié)果顯示：A1B2C2D2時可溶性膳食纖維的得率最高，即菌種接種量為2.5%，pH為6.4，料液比為18，發(fā)酵時間為20 h，此時葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的得率高達(dá)29%。均值分析表明最優(yōu)的工藝條件為A1B2C1D2，即菌種接種量為2.5%，pH為6.4，料液比16，發(fā)酵時間20 h。驗證試驗顯示：A1B2C1D2時葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率為29.2%，略高于A1B2C2D2的得率。

3 結(jié)論與討論

本研究以葡萄皮渣粉為原料提取SDF，試驗結(jié)果顯示：菌種接種量為2.5%，pH為6.4，料液比為16(g·mL-1)，發(fā)酵時間20 h時，葡萄皮渣中可溶性膳食纖維得率達(dá)到29.2%。

令博等[15]通過發(fā)酵法提取葡萄皮渣中的膳食纖維的工藝條件為發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間21 h、接種量1%、料液比110，在此條件下SDF得率為(17.25±0.23)%；郭紅珍等[16]用酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的最佳工藝為pH為7.0、50 ℃水浴條件下、加酶量50 μL·g-1，作用時間6 h，此條件下得到的可溶性膳食纖維為28.8%。