孫會剛,陳志軒,卞路遙，陳學紅,周中馳,李同祥

(徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018)

近年來，天然防腐劑因其高效、安全、廣譜等特點逐漸成為食品防腐劑領域研究的熱點[1]，天然植物提取物更是由于含有酚類、有機酸、類黃酮類化合物，常被用來作為亞硝酸鈉功能替代品應用到食品防腐領域[2]。本文對兩種徐州地區(qū)特色的食用植物進行復配后提取活性物質，并將其應用于食品防腐保鮮，顯示了較好的效果。

牛蒡是菊科牛蒡屬直根系二年生大型草本植物，原產于我國，為我國傳統(tǒng)中藥中的一種。牛蒡根中富含菊糖、纖維素、蛋白質、氨基酸以及鈣、磷、鐵等人體所需的多種營養(yǎng)物質和礦物質，而且其具有多種生理活性，它不僅可以清除體內垃圾，改善體循環(huán)，尤其對糖尿病、性機能減退、肥胖癥、風濕等病癥有明顯效果[3]。已有文獻報道關于牛蒡活性物質的提取、抗菌等方面的研究。牛蒡在食品方面的應用主要是牛蒡相關保健食品的開發(fā)，如牛蒡茶、牛蒡飲料、牛蒡醬等[4]；牛蒡提取物在食品防腐保鮮方面也有報道，如方海峰等研究了牛蒡乙醇提取液對藍莓有明顯的保鮮效果[5]；賀菊萍等研究發(fā)現(xiàn)牛蒡皮提取液對豬肉中腐敗菌單增李斯特菌具有較好的抑制作用[6]；崔莉等研究證明牛蒡復合保護劑能夠提高益生菌的耐受性[7]。

苔干，又名響菜、貢菜，為植物系菊科萵苣屬莖用萵苣，是我國江蘇邳州市和安徽渦陽縣義門鎮(zhèn)的名優(yōu)特產蔬菜，迄今已有兩千多年的種植歷史。苔干中含有豐富的氨基酸、果膠、多糖、黃酮類、酚類物質以及各種無機鹽，具有健胃、利水、清熱解毒等功能，有“天然保健品”、“植物營養(yǎng)素”之稱。目前，已有文獻報道關于苔干活性成分及其抑菌方面的研究[8]，根據以上研究，可以得出苔干提取物具有良好的抑菌作用，其在食品防腐保鮮方面的應用報道較少，僅有盧臣等報道通過試驗確定了苔干乙醇提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌有良好的抑制作用，對饅頭、圣女果、橘子、濕面條均有不同程度的防腐保鮮作用[9]。苔干在食品防腐保鮮方面的研究還需要更加全面、深入的開展。

本研究擬對苔干和牛蒡復配后活性物質提取條件進行優(yōu)化，并研究其對抗菌活性的影響及其在食品方面的防腐保鮮作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料：牛蒡(burdock)：購于徐州豐縣；苔干(dried moss)：購于徐州邳州。

菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，簡稱單增李斯特菌)，均為實驗室保存。

試劑：氯化鈉、瓊脂粉，天津市福晨化學試劑廠；胰蛋白胨、酵母浸出粉，上海國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯，上海博微生物科技有限公司；無水乙醇，上海凱沃生物技術有限公司。

1.2 儀器設備

IS-RDH2恒溫恒濕振蕩器 上海欣蕊自動化設備有限公司；303-1電熱恒溫培養(yǎng)箱 紹興市銀河機械設備有限公司；GS-700高速多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿有限公司；低溫臺式離心機 北京聯(lián)合科力科技有限公司；KQ5200DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Christ Alpha 1-2 LSC真空冷凍干燥機 德國Christ公司；RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛蒡苔干復配后活性物質的提取

1.3.1.1 牛蒡與苔干的處理

牛蒡：將新鮮牛蒡根莖洗凈后切塊，用2%的檸檬酸溶液浸泡10 min，于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，用高速多功能粉碎機粉碎，過40目篩，用無菌袋收集，置于4 ℃冰箱中備用。

苔干：將苔干置于去離子水中進行復水，洗凈后，放入恒溫干燥箱內，于60 ℃烘干至恒重，用高速多功能粉碎機粉碎，過40目篩，用無菌袋收集，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.1.2 提取液的制備

考慮到在食品防腐中的應用，本試驗采用超聲波輔助提取法[10]，用乙醇來提取牛蒡和苔干中的抑菌活性物質。準確稱量4份10 g牛蒡粉與苔干粉，分別置于4個錐形瓶中，按料液比1∶10，再分別量取100 mL的80%乙醇和水加入錐形瓶中。充分混勻后，將4個錐形瓶放入超聲清洗器中，于室溫28 ℃下密封浸提1 h。待原料浸提完成后，將提取液進行抽濾，并將濾液于旋轉蒸發(fā)儀中在45 ℃下濃縮至10 mL，得到原液(原液濃度為1 g/mL)。

1.3.2 牛蒡和苔干的復配

將牛蒡粉與苔干粉分別按6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8的比例混合，按上述提取液的制備方法進行抗菌物質的提取。

1.3.3 抑菌試驗

采用牛津杯法[11]。

1.3.4 牛蒡與苔干復配提取的單因素試驗

在提取過程中發(fā)現(xiàn)，影響牛蒡和苔干抗菌活性物質有4個主要因素，分別是提取溫度、提取時間、乙醇濃度及復配比。將提取溫度28 ℃、60%乙醇、料液比1∶10、牛蒡與苔干的復配比5∶5、用超聲波輔助提取且提取時間60 min設定為前提條件，每個因素選取5個變量，分別是28，45，55，65，75 ℃；20，40，60，80，100 min；水、20%、40%、60%和80%乙醇；6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8進行優(yōu)化。在單因素試驗的基礎上，選擇對抑菌活性影響最大的3個水平進行正交試驗進一步優(yōu)化。

1.3.5 牛蒡與苔干復配提取的正交試驗

為綜合考慮各個因素影響的主次順序，在單因素試驗的基礎上確定影響每個因素的3個水平，按正交表L9(34)安排試驗，試驗結果以抑菌圈直徑大小來表示，試驗結果需重復3次取平均值。根據極差的大小確定影響牛蒡和苔干提取工藝的主要與次要因素。

1.3.6 牛蒡與苔干提取液在食品防腐保鮮中的應用

1.3.6.1 腐爛程度

水果、蔬菜及其他種類食品在其日常的保藏過程中腐爛、發(fā)霉的現(xiàn)象普遍存在，因此防止食品發(fā)生或者減緩其腐敗成為食品保藏運輸中最令人關注的問題。本文中食品的腐爛程度主要以腐爛指數[12]為指標進行評價，具體見下式：

腐爛級別：0級為無腐爛；1級為0～1/4面積腐爛；2級為1/4～1/2面積腐爛；3級為1/2～3/4面積腐爛；4級為3/4～1面積腐爛。

1.3.6.2 提取物對饅頭的防腐保鮮作用

購買新鮮饅頭，均勻切成12塊，分為4組，每3塊為一組作為平行試驗組。用1倍和0.5倍的提取液分別充分噴灑在分好的3組饅頭上，以噴灑無菌水和噴灑0.5%山梨酸鉀的組合作為對照組，用保鮮膜包好之后放在37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，觀察饅頭的腐敗情況。

1.3.6.3 提取物對香蕉的防腐保鮮作用

從水果店購買香蕉，用去離子水洗凈，分為4組，每3根為一組作為平行試驗組。用1倍和0.5倍的提取液分別充分噴灑在分好的3組香蕉上，以噴灑無菌水和0.5%山梨酸鉀的組合作為對照組，用保鮮膜包好之后放在37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，觀察香蕉的腐敗情況。

1.3.6.4 提取物對番茄的防腐保鮮作用

準備8個大小一致的新鮮小番茄，分為4組，每2個為一組作為平行試驗組。將番茄洗凈，自然晾干后，切片處理，置于培養(yǎng)皿中[13]。用1倍和0.5倍的提取液分別噴灑在分好的4組小番茄上，以噴灑無菌水和0.5%山梨酸鉀的組合作為對照組，用保鮮膜包好之后放在37 ℃培養(yǎng)箱內觀察番茄的腐爛情況。

2 結果與分析

2.1 苔干和牛蒡復配活性物質提取單因素優(yōu)化

2.1.1 提取溫度對復配提取物抑菌活性的影響

提取溫度對復配提取物的抑菌活性有一定影響(見圖1)，在設定的提取條件下，28～55 ℃提取物的活性逐漸升高，55～75 ℃趨于穩(wěn)定，略有下降。原因可能是隨著溫度升高，活性物質的溶解度增加，繼續(xù)升高溫度可能對活性物質的穩(wěn)定造成一定影響而導致活性下降，其最適提取溫度為55 ℃。故正交試驗選取提取溫度為45，55，65 ℃ 3個水平。

圖1 提取溫度對復配提取物活性的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the activity of compound extract

2.1.2 提取時間對復配提取物抑菌活性的影響

提取時間對復配提取物的抑菌活性有一定影響(見圖2)，在設定的提取條件下，80 min為最優(yōu)，提取時間過短，溶解不充分；時間過長，影響活性物質的穩(wěn)定性，故提取物活性會下降。故正交試驗選取提取時間為60，80，100 min 3個水平。

圖2 提取時間對復配提取物活性的影響Fig.2 Effect of extraction time on the activity of compound extract

2.1.3 復配比對復配提取物抑菌活性的影響

復配比對復配提取物的抑菌活性有一定影響(見圖3)，牛蒡與苔干復配比為4∶6時，抑菌活性最好，而牛蒡與苔干復配比為3∶7、2∶8時，抑菌活性較低，所以選擇復配比為6∶4、5∶5、4∶6 3個水平進行下一步的正交試驗。

圖3 復配比對復配提取物活性的影響Fig.3 Effect of compound ratio on the activity of compound extract

2.1.4 乙醇濃度對復配提取物抑菌活性的影響

乙醇濃度對復配提取物的抑菌活性有較大的影響(見圖4)，當乙醇濃度為40%時，復配提取物的抑菌活性最高，當乙醇濃度為95%時提取率最低，因此選取乙醇濃度為20%、40%、60% 3個水平進行正交試驗優(yōu)化。

圖4 乙醇濃度對復配提取物活性的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the activity of compound extract

2.2 苔干和牛蒡復配活性物質提取正交試驗

由表1～表3正交試驗結果可知，以對食品常見腐敗菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性為考察指標，均為試驗7 A3B1C3D2為最佳復配物提取條件，即提取溫度為65 ℃，提取時間為60 min，復配比為4∶6，乙醇濃度為40%。

表1 復配提取物對大腸桿菌抑菌活性的正交試驗Table 1 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Escherichia coli

表2 復配提取物對金黃色葡萄球菌抑菌活性的正交試驗Table 2 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Staphylococcus aureu

表3 復配提取物對蠟樣芽孢桿菌抑菌活性的正交試驗Table 3 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Bacillus cereus

2.3 抑菌試驗

按照上述抑菌試驗方法，對牛蒡、苔干、牛蒡苔干復配提取物優(yōu)化前、牛蒡苔干復配提取物優(yōu)化后進行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)復配優(yōu)化后提取物的抑菌活性比牛蒡、苔干單獨的提取物及復配優(yōu)化前的提取物抑菌活性都要好(見圖5)。同時本試驗也比較了牛蒡、苔干的水提取物，發(fā)現(xiàn)兩者的乙醇提取物比水提取物的抑菌活性更好(見圖6)，所以復配后選取進行乙醇提取并優(yōu)化。

圖5 復配比對復配提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect of compound ratio on antibacterial activity of compound extract

圖6 優(yōu)化后的提取物與牛蒡、苔干單獨提取物抑菌活性比較Fig.6 Comparison of the antibacterial activity of the optimized extract and extract of burdock and dried moss alone

2.4 復配提取活性物質防腐保鮮作用

2.4.1 腐爛程度

根據上述方法考察復配提取液對鮮切番茄、香蕉、饅頭腐爛指數的影響。以無菌水和0.5%山梨酸鉀作為對照，試驗結果顯示復配提取物對3種食品均有一定的防腐作用，且對饅頭的防腐效果最好，且1倍的提取液對香蕉的防腐效果比0.5倍的提取液明顯更好，見表4。

表4 復配提取物對番茄、香蕉、饅頭腐爛指數的影響Table 4 Effects of compound extract on decay indexes of tomato, banana and steamed bread

2.4.2 鮮切番茄保藏過程的表觀評定

由圖7可知，復配提取液的0.5倍、1倍以及0.5%的山梨酸鉀對鮮切番茄的防腐保鮮效果均比無菌水好。無菌水噴灑過的鮮切番茄出現(xiàn)大面積發(fā)霉變質，0.5%山梨酸鉀對鮮切番茄的保鮮效果較好，而經過提取液噴灑后的鮮切番茄僅有少面積發(fā)霉變質，有效地延遲了腐敗時間。

圖7 復配提取物對鮮切番茄的防腐試驗Fig.7 Preservation test of compound extract on fresh-cut tomato

2.4.3 香蕉保藏過程的表觀評定

由圖8可知，噴灑無菌水的香蕉出現(xiàn)了大面積的黑色斑點，香蕉的果肉出現(xiàn)輕微黑色，而噴灑了1倍復配提取液的香蕉防腐狀態(tài)較好，防腐效果其次是0.5%的山梨酸鉀與0.5倍的提取液。

圖8 復配提取物對香蕉的防腐試驗Fig.8 Preservation test of compound extract on banana

2.4.4 饅頭保藏過程的表觀評定

對于饅頭的防腐效果(見圖9)，1倍復配提取液對饅頭的防腐效果最佳，無明顯腐敗現(xiàn)象，其次防腐效果為山梨酸鉀溶液，而無菌水的腐敗情況最嚴重且大面積發(fā)霉。

圖9 復配提取物對饅頭的防腐試驗Fig.9 Preservation test of compound extract on steamed bread

3 結語

植物源天然防腐劑應用于食品防腐保鮮的研究很多，如洪軍等研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮提取物對5種食源性致病菌具有很好的抑菌作用，并可將冷卻雞肉的保鮮延長至10 d左右[14]；閆佳佳等研究了漢麻葉黃酮成分及其抑菌活性，發(fā)現(xiàn)該植物成分對3種食源性致病菌的抑菌效果較為明顯[15]。天然防腐劑因其安全性和抑菌廣譜性，在調味品防腐保鮮方面也具有較大的應用潛力，如李惠等研究發(fā)現(xiàn)微生物源天然防腐保鮮劑Nisin顯著抑制番茄醬菌落總數的增加[16]；郭俊華制備的復合調味品姜醬使用了植物源的有效成分R-多糖和植酸，取得了較好的防腐保鮮效果[17]；孫瑩用丁香和桂皮作為復配防腐劑將低鹽醬加工成具有良好防腐保鮮效果的調味低鹽醬[18]。本研究用到的材料牛蒡和苔干提取物應用于食品防腐保鮮方面的研究較少，對牛蒡和苔干兩種植物材料進行復配后提取活性物質也屬首次，對于植物源天然防腐劑的開發(fā)具有一定的借鑒價值。

牛蒡和苔干都能產生多種活性物質，本文采用復配的方法提取其中的活性物質，通過單因素和正交試驗優(yōu)化其活性物質提取工藝，獲得了最優(yōu)的提取方案。通過抑菌試驗證明，復配后其抑菌活性比牛蒡、苔干單獨提取物的抑菌活性明顯增強。用無菌水和0.5%山梨酸鉀作為對照驗證牛蒡、苔干復配提取物在食品中的防腐作用，結果顯示其具有較好的防腐保鮮效果。且牛蒡、苔干又含有大量的活性成分，用其復配物作為防腐保鮮劑添加到食品中又具有一定的保健功能，對于新型功能性食品的開發(fā)提供了一個新的思路。