文明，王毛毛，王雪婷，王如福

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

綠豆(PhaseolusradiatusL.)，屬于豆科、蝶形花科(Papilionoideae)、菜豆族(Phaseoleae)、豇豆屬(Vigna)中的一個(gè)種，是溫帶地區(qū)廣泛種植的豆類之一[1]。綠豆?fàn)I養(yǎng)豐富，籽粒中蛋白質(zhì)含量高達(dá)19.5%～33.1%，明顯高于禾谷類作物，到目前為止已從綠豆中鑒定出多種化合物，如黃酮類、花青素、皂苷、植物甾醇等[2]。

小米(Setariaitalica)，又稱粟米，是禾本科(Gramineae)、狗尾草屬(Setaria)植物，直徑約1 mm，屬雜糧作物，是世界上最古老的雜糧作物之一[3]。小米營(yíng)養(yǎng)豐富，主要含有多酚、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和各種礦物質(zhì)等，營(yíng)養(yǎng)素搭配合理，人體利用消化率高[4-5]。

食醋是一種酸性調(diào)味品，采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝釀造，不僅具有獨(dú)特的風(fēng)味，而且富含營(yíng)養(yǎng)及多種功能因子。傳統(tǒng)食醋中的抗氧化活性成分有多酚、黃酮、蛋白黑素和川芎嗪等，可以抵抗機(jī)體的氧化應(yīng)激，具有預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗衰老和保護(hù)肝臟的作用。隨著人們生活水平及對(duì)食醋營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健功能認(rèn)識(shí)的提高，單一的食醋品種已不能滿足不同層次、不同消費(fèi)者的需求。小米和綠豆除了具有豐富的蛋白質(zhì)以外還有大量的淀粉，所以其能夠作為食醋釀造的原料，由于人體在消化和吸收蛋白質(zhì)過程中，蛋白中的各種氨基酸需要合適的比例才能夠充分地被吸收和利用，而當(dāng)某種蛋白中的氨基酸不能達(dá)到這一比例時(shí)，即使食物中蛋白質(zhì)含量再高，也不能被人體充分利用[6-7]。因?yàn)橘嚢彼釣樾∶椎牡谝幌拗菩园被醄8]，而綠豆的賴氨酸含量較高，基于上述理論，可以選擇綠豆作為小米蛋白利用價(jià)值的互補(bǔ)原料。

目前國內(nèi)外，對(duì)于小米和綠豆的研究大多集中在功能成分上或是某一種原料的產(chǎn)品加工上，朱文學(xué)等[9]通過超聲波輔助水提工藝提取綠豆皮中的黃酮類物質(zhì)，最佳提取工藝為超聲功率419 W、超聲溫度70 ℃、超聲時(shí)間75 min、料液比1∶45(g/mL)；Sharma等[10]研究發(fā)現(xiàn)，小米多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、蠟狀芽孢桿菌和腸膜明串珠菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用；潘潔瓊等[11]通過正交試驗(yàn)對(duì)固態(tài)法小米醋釀造工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終釀造出的小米醋小米香味突出、酸味柔和。但是對(duì)于小米和綠豆發(fā)酵產(chǎn)品的研究還有所缺失，所以對(duì)于小米綠豆糖化液的研究顯得意義重大。在小米綠豆發(fā)酵產(chǎn)品的釀造過程中，糖化階段是一個(gè)保留功能成分和進(jìn)一步發(fā)酵的重要階段，因?yàn)樵诩訜嵴糁蟮倪^程中會(huì)導(dǎo)致許多功能成分的損失以及影響到微生物的生長(zhǎng)代謝，從而直接影響后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，所以本試驗(yàn)將對(duì)小米綠豆糖化液的制備進(jìn)行工藝優(yōu)化。

本試驗(yàn)以小米、綠豆和高粱為原料，以氨基酸態(tài)氮、還原糖和總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過對(duì)單因素的分析、Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化小米綠豆的糖化工藝，旨在確定小米綠豆糖化的最佳工藝，為進(jìn)一步研究小米綠豆醋提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米：產(chǎn)自山西省長(zhǎng)治市沁縣；綠豆：產(chǎn)自山西省大同市云州區(qū)；α-淀粉酶(1×105U/g)；糖化酶(4×105U/g)；酸性蛋白酶(1×105U/g)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1組織搗碎機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Starter 2C pH計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司；722型可見光分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以氨基酸態(tài)氮、還原糖和總黃酮含量為指標(biāo)，固定因素水平為α-淀粉酶添加量為200 U/g，液化時(shí)間為40 min，液化溫度為70 ℃，糖化酶添加量為1500 U/g，糖化時(shí)間為50 min，糖化溫度為70 ℃，加水量為300%，蛋白酶添加量為1000 U/g，高粱添加量為10%。設(shè)置單因素試驗(yàn)：α-淀粉酶添加量(0，100，200，300，400 U/g)、液化時(shí)間(10，20，30，40，50 min)、液化溫度(60，70，80，90，100 ℃)、糖化酶添加量(500，1000，1500，2000，2500 U/g)、糖化時(shí)間(30，40，50，60，70 min)、糖化溫度(55，60，65，70，75 ℃)、加水量(200%、300%、400%、500%、600%)、蛋白酶添加量(100，200，300，400，500 U/g)、高粱添加量(0%、5%、10%、15%、20%)9個(gè)因素對(duì)小米綠豆糖化醪的氨基酸態(tài)氮、還原糖和總黃酮含量的影響。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定各個(gè)因素的范圍，以小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮的綜合評(píng)分為響應(yīng)值，通過Plackett-Burman試驗(yàn)從9個(gè)因素中選出對(duì)小米綠豆糖化醪有顯著影響的因素。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于PB試驗(yàn)的結(jié)果，選取α-淀粉酶添加量、液化時(shí)間、糖化酶添加量、糖化時(shí)間4個(gè)影響顯著的因素，以小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮含量的綜合評(píng)分為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.5 測(cè)定方法

還原糖含量的測(cè)定：通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法進(jìn)行測(cè)定[12]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=1.4165x-0.0386，R2=0.9966。

總黃酮含量的測(cè)定：參考GB/T 19777-2013，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.431x-0.0082，R2=0.9974，其中y為吸光值，x為蘆丁質(zhì)量。

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：參考GB/T 13662-2018。

1.3.6 綜合評(píng)分

小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮含量的綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The comprehensive scoring standards

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 10以及Origin 9處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米綠豆糖化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 α-淀粉酶添加量、液化時(shí)間及液化溫度的確定

由圖1中a可知，隨著α-淀粉酶添加量的增加，氨基酸態(tài)氮的含量無明顯變化，還原糖與總黃酮含量逐漸增加最終趨于平緩，這是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)與α-淀粉酶可通過疏水作用、氫鍵或范德華力產(chǎn)生結(jié)合作用，其結(jié)合到酶的非活性中心部位，對(duì)α-淀粉酶表現(xiàn)出非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[13]，隨著黃酮含量的增加，導(dǎo)致對(duì)α-淀粉酶的抑制性增強(qiáng)，使得還原糖含量的增長(zhǎng)趨于平緩。

a

由圖1中b可知，液化時(shí)間對(duì)小米綠豆糖化醪的影響顯著(P≤0.05)，氨基酸態(tài)氮含量則變化不明顯，總黃酮含量先升高后降低，還原糖含量在10～40 min時(shí)增長(zhǎng)迅速，在40 min后增長(zhǎng)平緩，主要是因?yàn)榈矸鄣囊夯^程大致分為兩個(gè)階段：最初α-淀粉酶作用于直鏈淀粉使其迅速分解，黏度快速降低；其次，再作用于支鏈淀粉產(chǎn)生葡萄糖和糊精等，同時(shí)促進(jìn)寡糖緩慢地分解為葡萄糖，從而促進(jìn)支鏈淀粉的液化，后一反應(yīng)比第一階段要慢[14]，所以在40 min后還原糖含量增長(zhǎng)逐漸平緩。

由圖1中c可知，隨著溫度的上升，氨基酸態(tài)氮含量略微下降，總黃酮含量逐漸升高而后趨于平緩，受氧化影響導(dǎo)致總黃酮含量有所下降[15]。在80 ℃時(shí)還原糖含量達(dá)到最大值，但其隨后逐漸降低，其原因是還原糖與氨基酸發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

2.1.2 糖化酶添加量、糖化時(shí)間及糖化溫度的確定

由圖2中a可知，氨基酸態(tài)氮幾乎不受糖化酶添加量的影響。在糖化酶添加量為1500 U/g時(shí)總黃酮含量開始逐漸下降，其原因是隨著糖化酶含量的增加，逐漸將總黃酮水解為異黃酮苷[16]。在糖化酶添加量為500～1500 U/g時(shí)，還原糖含量增長(zhǎng)迅速，在1500～2500 U/g范圍內(nèi)還原糖含量增長(zhǎng)緩慢，原因是在糖化酶添加量低于1500 U/g時(shí)，糖化酶與底物充分反應(yīng)導(dǎo)致糖化反應(yīng)受酶添加量的影響較大，當(dāng)糖化酶含量大于1500 U/g時(shí)，糖化酶的添加量已過量，所以還原糖含量增長(zhǎng)緩慢。

a

由圖2中b可知，在糖化前期，氨基酸態(tài)氮的含量基本不受影響，然而總黃酮含量與還原糖含量逐漸增加，但隨著時(shí)間的增加，糖化酶作用的底物濃度逐漸降低，使得還原糖含量在60 min后增長(zhǎng)變緩，這時(shí)糖化酶則對(duì)總黃酮進(jìn)行水解，導(dǎo)致總黃酮含量下降。

由圖2中c可知，隨著溫度的逐漸升高，氨基酸態(tài)氮含量略微下降，總黃酮和還原糖含量先升高后下降，其主要原因是溫度過高導(dǎo)致糖化酶活性降低使得還原糖含量下降，受氧化影響導(dǎo)致總黃酮含量下降。

2.1.3 高粱添加量、蛋白酶添加量及加水量的確定

由圖3中a可知，隨著高粱添加量的增加，氨基酸態(tài)氮的含量逐漸減小，而總黃酮和還原糖的含量隨著高粱添加量的增加逐漸增大，原因是高粱的支鏈淀粉含量高于小米和綠豆，所以隨著其添加量的增加還原糖的含量也隨之增加，并且高粱淀粉的加入使得糊化穩(wěn)定性增強(qiáng)[17]。

由圖3中b可知，隨著蛋白酶添加量的增加，還原糖和氨基酸態(tài)氮的含量逐漸上升，總黃酮的含量先上升后趨于平緩，其作用機(jī)理是蛋白酶作用于原料中的蛋白質(zhì)，使得與蛋白質(zhì)相結(jié)合的黃酮類物質(zhì)析出，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮和黃酮類物質(zhì)含量上升[18]。

a

由圖3中c可知，隨著加水量的增加，還原糖、總黃酮含量都先增加后減少，其作用機(jī)理是蛋白質(zhì)含有-COOH、-NH3、-OH等親水性基團(tuán)，所以加水量少時(shí)導(dǎo)致小米綠豆醪液黏稠使得還原糖、總黃酮含量不易析出[19]，而加水量過多會(huì)導(dǎo)致還原糖、總黃酮和氨基酸態(tài)氮濃度過低。

2.1.4 參數(shù)確定

通過對(duì)單因素結(jié)果的分析確定α-淀粉酶添加量為300 U/g，液化時(shí)間為40 min，液化溫度為80 ℃，糖化酶添加量為1500 U/g，糖化時(shí)間為60 min，糖化溫度為60 ℃，高粱添加量為15%，蛋白酶添加量為300 U/g以及加水量為原料的400%，由于氨基酸態(tài)氮在糖化階段相對(duì)穩(wěn)定，所以在后續(xù)的試驗(yàn)中不再將其設(shè)置為考察指標(biāo)。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)確定關(guān)鍵影響因素

以小米綠豆糖化醪還原糖含量和總黃酮含量為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman test design and results

由表3可知，分別以還原糖、總黃酮為響應(yīng)值建立回歸模型顯著?；貧w模型方程為：還原糖含量=-0.20+0.005130A+0.03157B-0.00021C+0.001051D+0.08305E+0.0281F+0.000478G+0.001407H+0.0046I；總黃酮含量=115.65-0.05233A-0.2768B+0.1069C+0.000502D+0.0527E+0.0790F-0.00432G+0.01226H-0.0916I；兩模型的R2分別為0.9915，0.9954，表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由表4可知，α-淀粉酶添加量對(duì)還原糖含量的影響顯著，對(duì)總黃酮含量的影響極顯著，液化時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響顯著，糖化酶添加量對(duì)還原糖含量的影響顯著，糖化時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響極顯著。所以PB試驗(yàn)篩選出主要影響因素為A α-淀粉酶添加量、B 液化時(shí)間、D糖化酶添加量和E糖化時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以小米綠豆糖化醪還原糖和總黃酮含量的綜合評(píng)分指標(biāo)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理和分析，結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken test design and results

續(xù) 表

經(jīng)過回歸擬合后得到小米綠豆糖化醪以綜合評(píng)分為響應(yīng)值的回歸方程為：綜合評(píng)分=+88.42+2.45A+1.31B+4.69C+9.17D-0.89AB-2.62AC-2.41AD-2BC-2.09BD-0.66CD-10.02A2-9.9B2-5.45C2-6.84D2，其中R2為0.9904，表明其因變量與其他自變量之間的多元關(guān)系顯著，RAdj2和 RPred2分別為0.9807和0.9460，兩者之間的差距小于0.2，所以該模型可信，則上述回歸方程可以預(yù)測(cè)4個(gè)因素對(duì)小米綠豆糖化工藝的影響。

表6 小米綠豆糖化醪綜合評(píng)分方差分析表Table 6 Analysis of variance of the comprehensive scores of millet and mung bean saccharifying mash

續(xù) 表

由表6方差分析結(jié)果可知，該模型回歸關(guān)系顯著，各因素對(duì)其綜合評(píng)分的影響大小為：糖化時(shí)間>糖化酶添加量>α-淀粉酶添加量>液化時(shí)間。

各因素及其交互作用對(duì)小米綠豆糖化醪綜合評(píng)分的影響結(jié)果可以通過響應(yīng)面圖直觀地反映出來，其中圖像底部的等高線可以反映兩因素相互作用的強(qiáng)弱，若是橢圓形則表示相互作用較強(qiáng)，圓形則表示較弱[20]。由圖4可知AB和CD的等高線為圓形，說明其交互作用對(duì)小米綠豆糖化醪綜合評(píng)分的影響不顯著，而AC、AD、BC以及BD為橢圓形，則說明其交互作用顯著，這與表6中的結(jié)果相符合。

由回歸方程擬合得到的小米綠豆糖化的最優(yōu)工藝條件為：α-淀粉酶添加量為306.927 U/g，液化時(shí)間為39.174 min，糖化酶添加量為1700.517 U/g，糖化時(shí)間為61.347 min，在此條件下小米綠豆糖化醪的綜合評(píng)分理論值為90.16分，還原糖含量為13.423 g/dL，總黃酮含量為163.745 mg/dL。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需要將工藝調(diào)整為α-淀粉酶添加量307 U/g、液化時(shí)間39 min、糖化酶添加量1700 U/g、糖化時(shí)間61.5 min。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證，得到糖化醪還原糖含量為12.85 g/dL，總黃酮含量為156.14 mg/dL，綜合評(píng)分為87.32分，與預(yù)測(cè)值相比誤差為3.15%，由此說明該模型的擬合程度良好，得到的小米綠豆糖化工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)對(duì)小米綠豆糖化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，篩選出α-淀粉酶添加量、液化時(shí)間、糖化酶添加量及糖化時(shí)間這4個(gè)顯著影響因素，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了小米綠豆的糖化工藝，最優(yōu)條件為α-淀粉酶添加量307 U/g、液化溫度80 ℃、液化時(shí)間39 min、糖化酶添加量1700 U/g、糖化溫度60 ℃、糖化時(shí)間61.5 min、加水量為原料的400%、蛋白酶添加量300 U/g以及高粱添加量15%。在此條件下，得到的小米綠豆糖化醪氨基酸態(tài)氮含量為0.127 g/dL，還原糖含量為12.85 g/dL，總黃酮含量為156.14 mg/dL，綜合評(píng)分為87.32分。