黃秋萍，曾振芳，韋友歡，黃秋嬋，羅麗園，鄭燕菲

(廣西民族師范學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 崇左 532200)

薜荔(FicuspumilaL.)又名涼粉子、涼粉樹、木蓮等，屬?？崎艑僦参?，常綠攀援或匍匐灌木，耐貧瘠且抗干旱，適應(yīng)性強(qiáng)，野生資源豐富且極易種植，主要分布在我國中部和南部[1]，是具有開發(fā)價(jià)值的天然植物資源。薜荔的藤、葉為藥用部分，具有解毒消腫、活血通絡(luò)、祛風(fēng)除濕等功效[2]。薜荔的果實(shí)可加工食用，如制成涼粉、加工成果凍等，是純天然的綠色食品。目前，關(guān)于薜荔果有效成分的研究主要集中于薜荔籽多糖的提取及生物活性的研究[3-6]。薜荔籽果膠具有調(diào)節(jié)血糖、血脂及提高腸道有益菌比例等藥理作用[7]；薜荔果實(shí)中的多糖提取液還具有提高免疫功能及改善腸道環(huán)境等效果[8]，但對薜荔果實(shí)中多酚的提取及應(yīng)用研究未見報(bào)道。

多酚是植物生長中重要的次生代謝產(chǎn)物，多酚類化合物廣泛存在于植物的莖、葉、根及果實(shí)中。植物多酚不僅表現(xiàn)出良好的抗氧化活性[9]，還具有抑菌、抗炎、防治心血管疾病、防癌抗癌及抑制腫瘤等藥理活性[10-12]，其開發(fā)與應(yīng)用已經(jīng)成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，而不同植物或同一植物中不同部位所含多酚的量及其抗氧化活性存在一定的差異。采用超聲波輔助法提取薜荔果中的多酚，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化薜荔果多酚的提取工藝條件，并通過薜荔果多酚對DPPH·及·OH的清除效果，考察薜荔果中多酚的抗氧化活性，為薜荔植物多酚的深入研究及進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于食品保健和藥品等領(lǐng)域提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薜荔果：2020年7月采摘于廣西崇左市石景林景區(qū)，洗凈，恒溫60 ℃烘干，粉碎(60目篩)備用。

單寧酸(純度≥99%)、福林酚、丙酮、DPPH等試驗(yàn)試劑：均為分析純。

FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SG2200HPT型超聲波清洗儀 上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[13]的方法，配制不同濃度梯度的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用福林酚顯色法顯色后分別測定它們在760 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程：y=93.7804x+0.0796，R2=0.9990，其中x為單寧酸溶液的質(zhì)量濃度，y為對應(yīng)的吸光度值。

1.2.2 薜荔果多酚的提取

稱取一定量已粉碎過60目篩的薜荔果粉末，用石油醚以1∶4(g/mL)的料液比在70 ℃的油浴條件下回流4 h完成脫脂、除色處理，再放置于60 ℃恒溫箱中干燥，即得脫脂脫色的薜荔果粉末原料。稱取已脫脂脫色的1.0000 g薜荔果粉末原料，加入定量丙酮溶液，于特定條件下超聲輔助提取，過濾，濾液定容至100 mL容量瓶中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 薜荔果多酚的定性分析

量取5 mL的薜荔果多酚提取液和單寧酸標(biāo)液，分別加入少量的0.3% FeCl3、1%明膠溶液，搖勻，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象；依次將1 mL 36%甲醛和2 mL濃鹽酸加入至10 mL薜荔果多酚提取液中，煮沸后回流30 min，以單寧酸為對照組，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象；取薜荔果多酚提取液0.1 mL進(jìn)行福林酚顯色，用紫外分光光度計(jì)掃描，以單寧酸作為對照。

1.2.4 薜荔果多酚得率的測定

按照1.2.1的福林酚顯色法顯色后測定提取液在760 nm處的吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算相關(guān)濃度，根據(jù)下式計(jì)算薜荔果多酚的得率：

式中：Y為薜荔果多酚的得率，%；WR為脫脂原料的質(zhì)量，g；C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出的濃度，mg/mL；V1為提取液的總體積，mL；V2為測定時(shí)量取的提取液體積，mL。

1.2.5 薜荔果多酚提取的單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 丙酮體積分?jǐn)?shù)

固定料液比1∶20(g/mL)，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間20 min，分別測定提取劑為30%、40%、50%、60%、70%時(shí)對應(yīng)的薜荔果多酚得率，確定合適的提取劑丙酮的體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5.2 料液比

固定50%丙酮為提取劑，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間20 min，分別測定料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)的對應(yīng)的薜荔果多酚的得率，確定合適的料液比。

1.2.5.3 提取溫度

固定50%丙酮為提取劑，料液比1∶30(g/mL)，提取時(shí)間20 min，分別測定提取溫度為50，60，70，80，90 ℃時(shí)對應(yīng)的薜荔果多酚的得率，確定合適的提取溫度。

1.2.5.4 提取時(shí)間

固定50%丙酮為提取劑，料液比1∶30(g/mL)，提取溫度60 ℃，分別測定提取時(shí)間為80，100，120，140，160 min時(shí)對應(yīng)的薜荔果多酚的得率，確定合適的提取時(shí)間。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，以丙酮體積分?jǐn)?shù)(%)、料液比(g/mL)、提取溫度(℃)及時(shí)間(min)為4個(gè)考察因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平 Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.2.7 薜荔果多酚抗氧化性的測定

以抗壞血酸為陽性對照，分別參照文獻(xiàn)[14-15]的方法測定最佳工藝條件下提取得到的薜荔果多酚對DPPH·及·OH的清除效果，以對應(yīng)清除率為參考指標(biāo)評價(jià)薜荔果中多酚的抗氧化活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)平行測定3次，取平均值，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖片繪制。

2 結(jié)果和分析

2.1 薜荔果多酚的定性分析結(jié)果

2.1.1 顏色反應(yīng)對比

以單寧酸溶液作對比，用薜荔果多酚提取液的顏色反應(yīng)進(jìn)行定性分析，結(jié)果見表2。

表2 定性分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental results of qualitative analysis

由表2可知，薜荔果提取液中含有多酚類物質(zhì)——單寧。

2.1.2 紫外可見光譜對比

經(jīng)福林酚顯色后的薜荔果多酚提取液和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液的紫外可見光譜見圖1。

圖1 薜荔果多酚的紫外可見光譜圖Fig.1 UV-vis spectra of polyphenols from Ficus pumila Linn.

由圖1可知，薜荔果多酚提取液和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液均在760 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，故選擇760 nm作為測定的吸收波長。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，薜荔果多酚的得率隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后降低。當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)對應(yīng)得率最大，為3.58%，繼續(xù)增大丙酮體積分?jǐn)?shù)，脂溶性物質(zhì)溶出增多，使得多酚的得率下降。因此，選取的最佳丙酮體積分?jǐn)?shù)為50%。隨著料液比濃度的增大，薜荔果多酚得率呈先升高后降低的趨勢，在1∶30 (g/mL)料液比時(shí)對應(yīng)的多酚得率最大，為4.45%，再繼續(xù)增大料液比則其他雜質(zhì)溶出也增多，從而導(dǎo)致多酚得率下降[16]，且不利于后續(xù)濃縮處理。因此，選取的最佳料液比為1∶30(g/mL)。隨著提取溫度由30 ℃升高至40 ℃時(shí)，對應(yīng)的薜荔果多酚得率顯著增加，但提取溫度范圍在40～60 ℃時(shí)多酚得率基本維持不變，而提取溫度高于60 ℃則多酚得率顯著降低。原因是低溫不利于酚類物質(zhì)的溶出，但溫度較高會(huì)使部分多酚氧化和降解，導(dǎo)致多酚得率降低[17]。因此，選取的最佳提取溫度為60 ℃。薜荔果多酚得率隨著提取時(shí)間的增加先升后降，提取時(shí)間過長則部分多酚物質(zhì)被氧化出現(xiàn)耗損也會(huì)被分解導(dǎo)致結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其得率降低[18]。因此，選取的最佳提取時(shí)間為120 min。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基準(zhǔn)，按表1的因素水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化薜荔果多酚提取工藝，確定最佳提取工藝條件，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 薜荔果多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The orthogonal experimental results of the extraction of polyphenols from Ficus pumila Linn.

由表3的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，對薜荔果多酚得率的影響因素順序?yàn)椋禾崛r(shí)間(D)>提取溫度(C)>丙酮體積分?jǐn)?shù)(A)>料液比(B)。因此，其最佳提取工藝條件為A1B3C3D3，即丙酮體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶35(g/mL)、提取溫度70 ℃及提取時(shí)間150 min。按上述的最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，對應(yīng)得到總黃酮的得率分別為4.60%、4.54%、4.62%，均值為4.59%，高于正交試驗(yàn)表中的最高得率4.44%，且RSD值小于5%，說明此試驗(yàn)所得結(jié)果穩(wěn)定且重現(xiàn)性較好。

2.4 薜荔果多酚的抗氧化性結(jié)果

2.4.1 薜荔果多酚清除DPPH·的能力

由圖3可知，隨著濃度的不斷增大，薜荔果多酚提取液對DPPH·的清除能力也逐漸增強(qiáng)，其清除能力與多酚提取液濃度呈正相關(guān)。薜荔果多酚濃度為0.05 mg/mL時(shí)，其對DPPH·的清除率為86.9%(相同濃度下Vc對DPPH·的清除率為97.1%)，IC50值是0.026 mg/mL，表明薜荔果多酚對DPPH·具有良好的清除能力，但是弱于Vc。

圖3 薜荔果多酚對DPPH·的清除效果Fig.3 Scavenging effect of polyphenols from Ficus pumila Linn. on DPPH·

2.4.2 薜荔果多酚清除·OH的能力

由圖4可知，薜荔果多酚對·OH的清除效果隨著其濃度增大而顯著增強(qiáng)，清除效果與濃度呈正相關(guān)。在薜荔果多酚濃度為0.9 mg/mL時(shí)，它對·OH的清除率達(dá)64.7%，低于同濃度下Vc對·OH的清除率86.5%，薜荔果多酚對應(yīng)的IC50值為0.72 mg/mL，表明薜荔果多酚具有一定的抗氧化性。

圖4 薜荔果多酚對·OH的清除效果Fig.4 Scavenging effect of polyphenols from Ficus pumila Linn.on ·OH

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助法提取薜荔果多酚的工藝，得到最佳提取工藝條件為：丙酮40%、料液比1∶35(g/mL)、提取溫度70 ℃及提取時(shí)間150 min，該條件下薜荔果多酚提取率為4.59%。薜荔果多酚對DPPH自由基的清除效果較顯著且具有清除羥自由基的能力，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對DPPH·和·OH的最大清除率分別為86.9%、64.7%，對應(yīng)的IC50值分別是0.026，0.72 mg/mL。薜荔果多酚清除自由基的能力與濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系，表明薜荔果多酚具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)。后續(xù)可對薜荔植物不同部分中的多酚進(jìn)行提取并對有效成分做進(jìn)一步的分離純化和鑒定，深入分析多酚各組分對抗氧化性的貢獻(xiàn)，構(gòu)筑薜荔植物中多酚的抗氧化活性與各有效成分之間的量效關(guān)系，為研究開發(fā)薜荔植物并作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、藥品領(lǐng)域提供了依據(jù)。