李躍華，周寧，寧月寶

(內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

我國(guó)生姜資源豐富，市場(chǎng)供求關(guān)系穩(wěn)定[1]。生姜不僅具有維持人體健康所必需的營(yíng)養(yǎng)素，還富含其他多種成分，如姜辣素﹑黃酮類、萜類、糖苷、甘油及微量礦物質(zhì)等。生姜的有效成分除用于制成強(qiáng)心劑、抗腫瘤劑、防暈劑和抗過敏制劑外，在保健方面也有應(yīng)用，如制成戒煙劑、口腔衛(wèi)生制劑、脫毛劑等[2]，其對(duì)某些細(xì)菌尤其對(duì)沙門氏菌具有很強(qiáng)的抑制作用[3]。生姜辛辣風(fēng)味的主要來(lái)源及主要活性成分——姜辣素，是一種非揮發(fā)性的油性液體，其在鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌、抗癌、止吐以及抗氧化等方面的效果顯著[4]，且在姜皮中含量較多，可以變廢為寶，帶來(lái)更大的社會(huì)效益[5]。黑姜，是以新鮮姜為原料，在一定溫度和濕度條件下發(fā)酵而成的一種姜制品，在加工過程中，黑姜自身的組織遭到破壞，其物質(zhì)發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)發(fā)酵后，成分和功能上都發(fā)生了一些變化，營(yíng)養(yǎng)成分和更強(qiáng)的生理活性更加豐富[6]。本文對(duì)發(fā)酵后的黑姜多糖進(jìn)行提取，測(cè)量多糖含量，用四氧嘧啶誘導(dǎo)小鼠復(fù)成糖尿病小鼠，分為高血糖組、中高血糖組，并對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行黑姜多糖灌胃。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黑姜多糖降血糖作用鮮有報(bào)道，本文通過提取黑姜多糖及對(duì)糖尿病小鼠的影響，為以后研究黑姜提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

新鮮生姜：購(gòu)于包頭市友誼菜市場(chǎng)；昆明小鼠(體重26～60 g，雄性)：購(gòu)于內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院。

生理鹽水：吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司；四氧嘧啶：博美生物科技有限責(zé)任公司；正丁醇：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯甲烷：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇：天津水晟精細(xì)化工有限公司；安穩(wěn)血糖儀、血糖試條：三諾生物傳感股份有限公司；葡萄糖：天津市化學(xué)試劑三廠；蒽酮：上海科豐試劑廠；硫酸：北京化工廠。

1.2 儀器

XMTD-204型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州諾海電子有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司；RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BCD-240SDPN型醫(yī)用冰箱 青島海爾股份有限公司；BPS-100CL恒溫恒濕發(fā)酵箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SORVALL LYNX 4000高速冷凍離心機(jī) Thermo Fisher Scientific公司；紫外可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SQP型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；一次性無(wú)菌注射器 蓮花醫(yī)療用品有限公司；Grant XB70型制冰機(jī)；HZQ-QG型全溫振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黑姜的制備

把新鮮生姜表面的雜質(zhì)灰塵用清水清洗干凈，再將生姜放入恒溫恒濕發(fā)酵箱中，設(shè)置發(fā)酵溫度65 ℃，濕度95%，發(fā)酵30 d，同時(shí)記錄每天發(fā)酵箱的溫度及濕度，等生姜顏色變黑，刺激性氣味減少后即可取出，得到成品黑姜[7]。

2.2 黑姜粗多糖的提取

在50 ℃烘箱中放入發(fā)酵完成的黑姜，干燥2周后取出，再將黑干姜磨成細(xì)粉，使其能夠通過60目篩子，得到最終黑色姜粉。

稱量20 g姜粉于500 mL燒瓶中，再加入500 mL超純水，放入70 ℃水浴鍋內(nèi)水浴2 h，再進(jìn)行離心，4000 r/min離心20 min，去除提取液中的黑姜粉末，保留上清液體，得到黑姜水提取液，把3次的提取液合并在一起[8]。

將提取液移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸發(fā)，濃縮至1/4體積；將提取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)，待燒瓶中液體濃縮至1/4體積時(shí)，關(guān)閉。

使用Sevage法除去黑姜水提液中的蛋白質(zhì)(Sevage法：正丁醇與三氯甲烷按體積比為4∶1配制溶液，以濃縮提取液的1/5體積加入濃縮提取液中)。

在黑姜水中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，室溫靜置12 h。

放入離心機(jī)，4000 r/min離心10 min，倒掉上清液，取出沉淀，再用無(wú)水乙醇、乙醚與丙酮各清洗沉淀2次，放在50 ℃烘箱中干燥12 h[9-10]。

將沉淀放入50 ℃烘箱中，干燥12 h后取出沉淀，放在研缽中研磨成粉末，即可獲得黑姜粗多糖粉末[11]。

2.3 黑姜多糖含量的測(cè)定

蒽酮硫酸法：100 mL 80%硫酸溶液加0.1 g蒽酮配制溶液，按表1加樣測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和黑姜多糖樣液吸光度[12]。

表1 蒽酮硫酸法加樣Table 1 Adding samples by anthrone sulfuric acid method

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.4.1 建立小鼠高血糖模型

2.4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

把小鼠隨機(jī)分成兩組，對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組20只。

2.4.1.2 小鼠稱重

用電子天平稱得30只小鼠平均體重約為38 g。

2.4.1.3 配制2%的四氧嘧啶溶液

使用四氧嘧啶溶液時(shí)，要注意現(xiàn)用現(xiàn)配且在避光條件下，實(shí)驗(yàn)需要配制2%的四氧嘧啶溶液，稱量1.300 g四氧嘧啶，放置于棕色瓶中，向瓶中加入生理鹽水65 mL，用玻璃棒進(jìn)行攪拌，使其充分溶解，即完成四氧嘧啶溶液的配制。

2.4.1.4 腹腔注射

使實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組小鼠處于同一避光環(huán)境中，在給小鼠注射藥劑時(shí)，讓所有小鼠禁食不禁水12 h，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射20 mg/kg 2%的四氧嘧啶溶液，再給對(duì)照組小鼠注射同樣劑量的20 mg/kg生理鹽水，完成腹腔注射過程。

2.4.1.5 測(cè)量并記錄小鼠血糖值

所有小鼠72 h腹腔注射后，讓小鼠禁食不禁水12 h，此時(shí)測(cè)量小鼠的空腹血糖值。為方便測(cè)量血糖，可將燒杯倒扣于小鼠，將小鼠尾巴經(jīng)杯口暴露在燒杯外，再用手壓住燒杯底部，防止小鼠亂移動(dòng)，再進(jìn)行采血，用采血針刺破露出燒杯口的小鼠尾端，用手順著尾巴將血擠壓出，吸入到血糖試紙中，采血完成后，用酒精將取血處進(jìn)行擦拭消毒。

2.4.1.6 糖尿病小鼠分組

測(cè)量小鼠血糖值，血糖濃度值小于7.0 mmol/L為建模失敗的小鼠，需進(jìn)行重新建模，重復(fù)2.4.1.3～2.4.1.5的步驟，當(dāng)測(cè)得的血糖濃度值大于7.0 mmol/L時(shí)為建模成功的高血糖小鼠，把建模成功的小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為高血糖模型對(duì)照組以及黑姜多糖組，再把歸到黑姜多糖組的小鼠進(jìn)行分組，測(cè)得血糖濃度值在7.0～17.0 mmol/L區(qū)間的小鼠為中高血糖組，血糖濃度值測(cè)得在17.0 mmol/L以上的小鼠為高血糖組[13]。

2.4.2 黑姜多糖灌胃

對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的小鼠進(jìn)行同步灌胃，劑量為400 mg/(kg·d)，持續(xù)灌胃4周，共計(jì)28 d。每只小鼠灌胃黑姜多糖的量約為1 mL，小鼠的個(gè)體差異隨體重波動(dòng)。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)算顯著性檢驗(yàn)P值。

3 結(jié)果

3.1 蒽酮硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)所測(cè)吸光度(見表2)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 所測(cè)吸光度Table 2 The measured absorbance values

根據(jù)上述步驟和數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve

由圖1可知，趨勢(shì)線方程y=5.635x+0.0593，當(dāng)OD625 nm值在0.1～0.5之間時(shí)，該曲線與趨勢(shì)線的契合度最高。

3.2 黑姜多糖含量的測(cè)定

由于黑姜多糖在市面上并無(wú)純品，所以用其水解后總單糖的濃度近似計(jì)算黑姜多糖的含量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)探索，發(fā)現(xiàn)以0.2 mg/mL黑姜粗多糖水溶液吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，測(cè)得的樣液0.8 mL時(shí)OD625 nm=0.300，帶入趨勢(shì)線方程后得出其單糖濃度為0.087 mg/mL，計(jì)算得出黑姜粗多糖中多糖含量為56.07%。

3.3 小鼠體重的變化

小鼠體重的變化見表3和圖2。

表3 小鼠體重的變化Table 3 Changes in body weight of mice

圖2 小鼠體重灌胃變化Fig.2 Changes in body weight of mice by intragastric administration

由表3可知，小鼠的體重變化在各時(shí)間內(nèi)的顯著性均大于0.05，說明小鼠的體重變化在各時(shí)間內(nèi)不存在顯著的差異性。圖2和表3顯示：小鼠體重有回升的趨勢(shì)，說明小鼠肝臟得到恢復(fù)。

3.4 小鼠血糖水平的變化

由表4可知，中高血糖組小鼠在灌胃第0周～第4周血糖值顯著下降(P<0.01)。

表4 小鼠血糖水平變化Table 4 Changes in blood glucose levels of mice

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從新鮮姜發(fā)酵后成為的黑姜中提取姜多糖，使用蒽酮硫酸法測(cè)定多糖含量，以及測(cè)定黑姜多糖對(duì)糖尿病小鼠的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑姜多糖對(duì)被四氧嘧啶誘導(dǎo)成的高血糖小鼠有較好的降血糖作用，尤其是對(duì)中高血糖的小鼠，血糖值明顯降低，回到正常血糖范圍，降糖效果顯著；對(duì)于高血糖值組的小鼠，大部分小鼠血糖值降到7.0～17.0 mmol/L，恢復(fù)到中高血糖值，另一部分小鼠血糖值得到良好效果，血糖值降到7.0 mmol/L以下，恢復(fù)到正常值；對(duì)非糖尿病小鼠的血糖值基本無(wú)影響，且對(duì)小鼠體重的影響較小。黑姜的研發(fā)有著良好的應(yīng)用前景，有關(guān)黑姜多糖的降血糖機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，其對(duì)糖尿病的治療值得研發(fā)與關(guān)注。