楊文君，相歡，段杉，崔春

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642；2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

豌豆(PisumsativumL.)是全球范圍內(nèi)主要種植和消費(fèi)的豆類之一，是碳水化合物(如纖維素、抗性淀粉和低聚糖)、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)的良好來源。豌豆種子含有21%～22%的蛋白質(zhì)，是一種比較理想的植物蛋白，特別是賴氨酸的含量高達(dá)1.5%[1-2]，另外還含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸等呈味氨基酸，因此是制備呈味基料的良好來源。

固體制曲是生產(chǎn)中國傳統(tǒng)發(fā)酵制品如醬油、豆豉等的關(guān)鍵工序，其目的在于使曲霉充分繁殖，產(chǎn)生豐富的酶系(如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等)，這些酶類對發(fā)酵制品的風(fēng)味和品質(zhì)有重要作用[3]。米曲霉是我國傳統(tǒng)釀造業(yè)使用的菌種，被美國FDA認(rèn)可為GRAS級別，已被廣泛運(yùn)用到多種傳統(tǒng)調(diào)味品、新型呈味基料及酶制劑的開發(fā)中。制曲的目的是使米曲霉在原料上充分生長，分泌發(fā)酵所需各種酶類，在后續(xù)的發(fā)酵中將原料中的蛋白質(zhì)、淀粉等分解成多肽、游離氨基酸、糖類等小分子物質(zhì)[4]。

蛋白酶活和淀粉酶活是評價(jià)成曲質(zhì)量的重要指標(biāo)，在米曲霉分泌的復(fù)合酶系的作用下，大分子的蛋白質(zhì)以及淀粉等物質(zhì)被降解成小分子多肽和葡萄糖等小分子物質(zhì)，對呈味起到關(guān)鍵性作用。本實(shí)驗(yàn)以豌豆和面粉比、豌豆蒸料時(shí)間、接種量以及制曲時(shí)間等指標(biāo)，研究了米曲霉對固體全豌豆制曲的影響[5]，以期為豌豆蛋白的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

豌豆：市售；曲精：滬釀3.042米曲霉孢子粉，佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司；面粉：山東魯王集團(tuán)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、碳酸鈉、三氯乙酸等常用化學(xué)試劑：均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；酪蛋白、可溶性淀粉：北京奧博星生物科技有限公司；乙腈：色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸：色譜純，上海阿拉丁公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Climace 11404人工氣候箱 廣州市科啟生物科技有限公司；SW-CJ-1FDA型超凈工作臺(tái) 蘇州安凈凈化技術(shù)有限公司；LDZX-40B型立式自控電熱蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠；Scientz-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；雷磁PHS-3E pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 米曲霉全豌豆固體制曲工藝優(yōu)化

1.3.1 成曲的制備流程

全豌豆固體→浸泡→蒸料→冷卻→混合面粉→接種→制曲→翻曲→出曲→測定酶活。

1.3.2 豌豆面粉比對成曲酶活力的影響

稱取固體全豌豆各100 g，分別置于燒杯中室溫下浸泡3 h，倒干水后連同紗布放入滅菌鍋中121 ℃蒸料15 min，然后分別按照100∶1、100∶5、100∶10、100∶15、100∶20的豌豆和面粉比加入面粉并混勻，同時(shí)接種1.0‰(以干豌豆質(zhì)量計(jì))的米曲霉，在溫度30 ℃、濕度90%的條件下培養(yǎng)48 h，于制曲的24 h后進(jìn)行第一次翻曲、36 h后第二次翻曲，出曲后分別測定中性蛋白酶活和淀粉酶活。

1.3.3 豌豆浸泡時(shí)間對成曲酶活力的影響

稱取固體全豌豆各100 g，分別置于燒杯中室溫下浸泡1，2，3，4 h，倒干水后連同紗布放入滅菌鍋中121 ℃蒸料15 min，然后按照100∶10的豌豆和面粉比加入面粉并混勻，同時(shí)接種1.0‰(以干豌豆質(zhì)量計(jì))的米曲霉，在溫度30 ℃、濕度90%的條件下培養(yǎng)48 h，于制曲的24 h后進(jìn)行第一次翻曲、36 h后第二次翻曲，出曲后分別測定中性蛋白酶活和淀粉酶活。

1.3.4 蒸料時(shí)間對成曲酶活力的影響

稱取固體全豌豆各100 g，分別置于燒杯中室溫下浸泡4 h，倒干水后連同紗布放入滅菌鍋中121 ℃分別蒸料5，10，15，20，25 min，然后按照100∶10的豌豆和面粉比加入面粉并混勻，同時(shí)接種1.0‰(以干豌豆質(zhì)量計(jì))的米曲霉，在溫度30 ℃、濕度90%的條件下培養(yǎng)48 h，于制曲的24 h后進(jìn)行第一次翻曲、36 h后第二次翻曲，出曲后分別測定中性蛋白酶活和淀粉酶活。

1.3.5 米曲霉接種量對成曲酶活力的影響

稱取固體全豌豆各100 g，分別置于燒杯中室溫下浸泡4 h，倒干水后連同紗布放入滅菌鍋中121 ℃蒸料15 min，然后按照100∶10的豌豆和面粉比加入面粉并混勻，同時(shí)分別接種0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰(以干豌豆質(zhì)量計(jì))的米曲霉，在溫度30 ℃、濕度90%的條件下培養(yǎng)48 h，于制曲的24 h后進(jìn)行第一次翻曲、36 h后第二次翻曲，出曲后分別測定中性蛋白酶活和淀粉酶活。

1.3.6 制曲時(shí)間對成曲酶活力的影響

稱取固體全豌豆各100 g，分別置于燒杯中室溫下浸泡4 h，倒干水后連同紗布放入滅菌鍋中121 ℃蒸料15 min，然后按照100∶10的豌豆和面粉比加入面粉并混勻，同時(shí)接種0.8‰(以干豌豆質(zhì)量計(jì))的米曲霉，在溫度30 ℃、濕度90%的條件下分別培養(yǎng)36，40，44，48，52，56 h，于制曲的24 h后進(jìn)行第一次翻曲、36 h后第二次翻曲，出曲后分別測定中性蛋白酶活和淀粉酶活。

1.4 成曲發(fā)酵液呈味規(guī)律探究

將全豌豆成曲磨碎，稱取15 g加水置于錐形瓶中(料液比1∶5)，于pH 5.5、45 ℃條件下發(fā)酵24 h，發(fā)酵液離心取上清液備用。測定發(fā)酵上清液中的蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、總糖、總酸含量以及肽分子量分布，并對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評定，探究豌豆成曲發(fā)酵過程中呈味物質(zhì)的釋放規(guī)律。

1.5 分析與測定方法

1.5.1 中性蛋白酶活、淀粉酶活的測定

參照QB/T 1803-1993。

1.5.2 水解度和蛋白質(zhì)回收率的計(jì)算[6]

1.5.3 還原糖、總酸的測定

還原糖的測定采用DNS法，總酸的測定參照GB/T 12456-1990中的NaOH滴定法。

1.5.4 成曲發(fā)酵產(chǎn)物感官評定

參照GB/T 19547-2004[7]和相歡等[8]的方法并稍加調(diào)整，采用SPME-DSE聯(lián)用法分析不同固形物濃度發(fā)酵對醬油香氣物質(zhì)的影響，感官評價(jià)小組包括5男5女，年齡在16～25歲，感官評價(jià)室的溫度為(24±1)℃。感官評定員在感官評定之前都經(jīng)過基本滋味培訓(xùn)，熟悉豌豆成曲發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特征和感官強(qiáng)度，滋味培訓(xùn)的標(biāo)準(zhǔn)品分別為1%蔗糖(甜味)、0.35%食用鹽(咸味)、0.2%味精(鮮味)、0.02 g/L鹽酸奎寧(苦味)、0.04%檸檬酸(酸味)。取10 mL樣品溶液置于燒杯中，評定員將樣品溶液全部倒入口中，并保持10 s左右，隨后將其吐出。使用評分法，0～9分制(0～1表示無感覺，2～3表示閾值感覺，4～5感覺微弱，6～7感覺中等，8～9感覺強(qiáng)烈)，用雷達(dá)圖表示定量描述分析結(jié)果[9]。

1.5.5 發(fā)酵產(chǎn)物肽分子量分布的測定

參照陳嘉輝[10]的方法稍作調(diào)整：將豌豆成曲發(fā)酵液凍干樣品加水稀釋至蛋白濃度為10 mg/mL，采用HPLC法過凝膠柱(TSK gel G2000 SWXL)測定發(fā)酵液中的肽分子量分布，流動(dòng)相比例為乙腈∶水∶TFA為25∶75∶0.1，流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm。以保留時(shí)間x為橫坐標(biāo)，相對分子質(zhì)量的對數(shù)y為縱坐標(biāo)，繪制相對分子質(zhì)量校正曲線并得到方程：y=-0.288x+8.1408，R2=0.985。

1.5.6 數(shù)據(jù)處理

本研究所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)進(jìn)行3次，使用OriginPro 2019、SPSS 14.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表繪制和ANOVA-單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全豌豆固體制曲工藝優(yōu)化

2.1.1 豌豆和面粉比對成曲酶活力的影響

面粉中的主要成分為淀粉，且來源廣泛，價(jià)格低廉，其合適的C/N以及曲料疏松度能為米曲霉生長代謝提供良好的碳源[11]。同時(shí)蛋白質(zhì)以麩膠蛋白和麥谷蛋白為主，谷氨酸含量高，是產(chǎn)生鮮味的重要來源[12]。碳源和氮源作為米曲霉分泌酶系的主要限制性底物，其添加量和比例對成曲的酶活力有著極其重要的影響[13]。

由圖1可知，隨著面粉添加量的增加，中性蛋白酶活力和淀粉酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在面粉添加量為10%時(shí)，中性蛋白酶活達(dá)到最大值1363.2 U/g，面粉添加量為15%時(shí)淀粉酶活力達(dá)到最大值128.7 U/g，兩種情況下米曲霉生長情況較好，成曲表面孢子濃密，均勻叢生，呈黃綠色，且曲香濃郁。這說明適當(dāng)?shù)拿娣厶砑恿坑欣诿浊沟纳L利用，過量的面粉添加量可能使豌豆外部包裹一層過于嚴(yán)密的面粉層進(jìn)而導(dǎo)致空氣流動(dòng)不暢通，從而抑制米曲霉的生理活動(dòng)而降低酶活[14]。考慮到中性蛋白酶是影響發(fā)酵產(chǎn)物呈味的最主要因素以及成本問題，最后選擇10%作為最佳面粉添加量。

圖1 豌豆和面粉比對成曲酶活力的影響Fig.1 Effect of the ratio of peas to flour on enzyme activity of finished koji

2.1.2 蒸料時(shí)間對成曲酶活力的影響

由圖2可知，隨著蒸料時(shí)間的不斷延長，豌豆成曲的中性蛋白酶活力和淀粉酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在蒸料時(shí)間為15 min時(shí)達(dá)到最大值，分別為1189.5 U/g和85.2 U/g。在蒸料的過程中，適當(dāng)?shù)母邷責(zé)崽幚硎沟么蠓肿拥鞍踪|(zhì)伸展，同時(shí)又能夠殺滅豌豆曲料中其他微生物，更有利于米曲霉的生長繁殖，提高成曲的質(zhì)量，若蒸料時(shí)間過長，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子過度變性，分子結(jié)構(gòu)松散紊亂，降低發(fā)酵利用度和蛋白質(zhì)的溶解度，微生物利用率低[15]。因此，最終選擇15 min為最佳蒸料時(shí)間。

圖2 蒸料時(shí)間對成曲酶活力的影響Fig.2 Effect of steaming time on enzyme activity of finished koji

2.1.3 米曲霉接種量對成曲酶活力的影響

由圖3可知，接種量對中性蛋白酶活力的影響有顯著性差異(P<0.05)。隨著接種量的不斷增加，中性蛋白酶活力先上升后下降，在0.8‰時(shí)達(dá)到最大值1213 U/g；淀粉酶活力呈現(xiàn)先增長后趨于平緩的趨勢，最大值為86.8 U/g，不同接種量之間無顯著性差異。當(dāng)接種量過小時(shí)，米曲霉生長總量不足，蛋白酶活力和淀粉酶活力相對較低；當(dāng)接種量過大時(shí)，菌體初始數(shù)量增大，造成了菌體間利用營養(yǎng)物質(zhì)競爭過大，從而影響孢子的成熟，最終影響酶活力[16]，這與劉超等[17]研究接種量對成曲酶活的影響趨勢一致。因此綜合考慮，選擇0.8‰作為最佳接種量。

圖3 接種量對成曲酶活力的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on enzyme activity of finished koji

2.1.4 制曲時(shí)間對成曲酶活力的影響

米曲霉的生長可分為4個(gè)階段：孢子發(fā)芽期、菌絲生長期、菌絲繁殖期、孢子著生期，酶系的分泌主要在菌絲繁殖期[18]，見圖4。

圖4 制曲時(shí)間對成曲酶活力的影響Fig.4 Effect of koji making time on enzyme activity of finished koji

由圖4可知，在24～36 h時(shí)，米曲霉生長處于菌絲生長期，曲料呈白色，中性蛋白酶及淀粉酶活力均較低。在36～48 h時(shí)，菌絲迅速繁殖，分泌大量酶系，中性蛋白酶活力在48 h時(shí)達(dá)到最大值1221.6 U/g，淀粉酶活力在44 h時(shí)達(dá)到最大值85.2 U/g，此階段曲料變成淡黃色，直至最后呈黃綠色。44 h以后米曲霉孢子進(jìn)入生長后期，處于過生長階段，中性蛋白酶活力顯著降低(P<0.05)，因此選取44 h為最佳制曲時(shí)間。

2.2 豌豆成曲發(fā)酵液呈味規(guī)律探究

2.2.1 豌豆成曲發(fā)酵液制備

稱取15 g粉碎后的豌豆成曲加一定量的水(料液比為1∶5)于錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至6.0，在45 ℃的條件下置于空氣搖床中發(fā)酵24 h，每隔3 h取一次樣備用。

2.2.2 豌豆成曲在發(fā)酵過程中水解度、蛋白回收率的變化趨勢

水解度和蛋白回收率是衡量蛋白質(zhì)發(fā)酵效率的重要指標(biāo)，由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長，水解度和蛋白回收率均呈現(xiàn)出先增大后趨于平緩的趨勢，在24 h時(shí)分別達(dá)到33.5%和47.8%，這說明米曲霉分泌的蛋白酶能夠較好地發(fā)酵豌豆中的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)、糖類等大分子物質(zhì)分解成一系列易于吸收的小分子物質(zhì)。

2.2.3 豌豆成曲在發(fā)酵過程中還原糖、總酸的變化趨勢

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長，還原糖的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵12 h時(shí)達(dá)到最大值3.1 g/dL，前期快速增長的原因是曲料中的糖類物質(zhì)在淀粉酶的作用下降解為葡萄糖等還原糖，后期由于還原糖的生成速率與利用速率相接近使還原糖含量逐漸保持穩(wěn)定[19]?？偹岷吭?～12 h內(nèi)快速增長，在12～24 h增長逐漸緩慢，這可能是因?yàn)榍捌诎l(fā)酵液中產(chǎn)酸率微生物生長繁殖產(chǎn)生酸性物質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致總酸含量升高，到酶解后期，酒精和乳酸等中間產(chǎn)物的積累又會(huì)對產(chǎn)酸微生物有一定的抑制作用，故到后期總酸含量逐漸趨于平穩(wěn)[20]。

2.2.4 豌豆成曲發(fā)酵產(chǎn)物肽分子量分布

采用凝膠色譜法測定發(fā)酵產(chǎn)物的肽分子量分布，結(jié)果見表1。

表1 豌豆成曲發(fā)酵產(chǎn)物肽分子量分布Table 1 The molecular weight distribution of peptides from the fermented products of pea finished koji

由表1可知，在豌豆成曲發(fā)酵3～24 h的過程中，產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量主要集中在5000 Da以下，并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，大分子量的肽段(>1000 Da)逐漸減少，小分子量肽段(<500 Da)逐漸增加，在發(fā)酵24 h后的組分中100～500 Da肽段達(dá)到了75.09%，有研究證明此肽段分子量在食品的呈味和增味中發(fā)揮著極其重要的作用[21]。這說明在米曲霉分泌的復(fù)合酶系的作用下，豌豆成曲中的大分子蛋白質(zhì)得到了深度的分解，產(chǎn)生了豐富的呈味肽以及游離氨基酸。

3 結(jié)論

通過測定中性蛋白酶活、淀粉酶活等指標(biāo)來探究不同因素對全豌豆固體制曲的影響，最終確定了豌豆和面粉比100∶10、豌豆蒸料時(shí)間15 min、接種量0.8‰、制曲時(shí)間44 h、制曲溫度30 ℃、濕度90%的最佳制曲工藝。在此條件下，中性蛋白酶活和淀粉酶活分別高達(dá)1221.6 U/g和85.2 U/g。

在最佳制曲工藝下對成曲進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在料液比1∶5、pH 6、45 ℃的條件下發(fā)酵24 h，得到的發(fā)酵液的水解度和蛋白回收率分別為33.5%和47.8%。呈味感官評價(jià)顯示發(fā)酵液具有顯著的咸味和鮮味，且隨著還原糖和總酸含量的顯著升高，甜味和酸味的協(xié)調(diào)感明顯上升，發(fā)酵液的風(fēng)味逐漸走向飽滿，是制備呈味基料的良好來源，也為豌豆的高值化利用提供了理論基礎(chǔ)。