李會(huì)玲，鄒家浩，雷 博，李德嫻，王 廣，張永濤，李 廣*

(1.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，西安 710016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

關(guān)中奶山羊是目前世界上最為優(yōu)秀的奶山羊品種之一，具有體型結(jié)實(shí)勻稱、遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)奶量高、奶質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。對(duì)良種奶山羊精液進(jìn)行低溫稀釋保存能極大程度的提高優(yōu)良公畜的利用率并降低繁殖成本，對(duì)人工授精技術(shù)的推廣以及奶山羊良種化進(jìn)程有很大的推動(dòng)作用[1]。精液稀釋液必須能為精子提供能量、營養(yǎng)物質(zhì)、適宜的滲透壓和pH等必須的生存條件，并增強(qiáng)精子存活率、延長(zhǎng)精子在低溫環(huán)境下的保存時(shí)間，以便于精子的運(yùn)輸保存及人工授精使用[2]。同時(shí)，精液稀釋時(shí)會(huì)使精液中的自然抗氧化劑、脂肪酸類物質(zhì)等重要成分的濃度改變，導(dǎo)致精子聚集、結(jié)構(gòu)受損等問題，影響精液保存效果[3]。本試驗(yàn)擬通過對(duì)不同稀釋液對(duì)奶山羊精子在4 ℃環(huán)境下精子活率和精子存活時(shí)間進(jìn)行比較，以篩選出最佳的奶山羊低溫保存稀釋液配方；同時(shí)利用該配方進(jìn)一步篩選關(guān)中奶山羊精液低溫保存最佳稀釋比例。以期為關(guān)中奶山羊優(yōu)良種質(zhì)資源的高效推廣利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑

試驗(yàn)用精液均采自陜西三原縣某種羊場(chǎng)的3只配種用優(yōu)秀關(guān)中奶山羊，年齡均為3歲，身體健康，體型結(jié)實(shí)，性欲旺盛。正常飼養(yǎng)，自由飲水。

無水葡萄糖，購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；乳糖，購自上海信裕生物科技有限公司；檸檬酸鈉、Tris(三羥基甲氨基甲烷)，購自Amresco公司；青霉素、鏈霉素、大豆卵磷脂，購自上海信帆生物科技有限公司；雙蒸水，自制；生理鹽水及新鮮雞蛋。

1.2 稀釋液配方

根據(jù)吳爽等[4-6]的相關(guān)研究，結(jié)合前期試驗(yàn)對(duì)配方進(jìn)行調(diào)整，選擇6種奶山羊低溫保存稀釋液配方(A、B、C、D、E和F)，具體配方如表1所示。按照表1的比例稱取各種試劑藥品，用雙蒸水進(jìn)行溶解，溶解后用濾器過濾備用。取新鮮雞蛋，用酒精棉球擦拭蛋殼進(jìn)行清潔消毒，待干燥后敲碎氣室端蛋殼，去掉蛋清取出卵黃，用無菌注射器刺破卵黃膜抽取卵黃，按表1的比例加到上述配制好的溶液中，并用磁力攪拌器攪拌至溶液均勻。所有配方配制完成后加入青霉素和鏈霉素，置于38 ℃水浴鍋中預(yù)熱備用。

1.3 精液采集與稀釋

使用假陰道法進(jìn)行精液的采集，精液采出后，立即在35～38 ℃下鏡檢，所采集的精液必須沒有異物，沒有異常氣味，色澤為乳白色或乳黃色，精子形態(tài)正常，精子活力在0.8以上，密度達(dá)到15億/mL以上，在顯微鏡下呈現(xiàn)“云霧狀”者方可用于下一步進(jìn)行稀釋。

鏡檢合格的精液等量分裝于無菌的離心管中，分別加入預(yù)熱好的6種稀釋液做2次1∶1的稀釋，2次稀釋時(shí)間間隔5 min，并編號(hào)標(biāo)記，稀釋完成后用16層紗布包裹置于4 ℃冰箱中保存，每3 h緩慢翻動(dòng)1次離心管，防止精子沉淀，每6 h對(duì)精液進(jìn)行1次鏡檢，直至精子全部死亡，統(tǒng)計(jì)各組精子各個(gè)時(shí)間段的活率、有效存活時(shí)間及總存活時(shí)間。

1.4 效果判定

精子活率指直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比；精子有效存活時(shí)間指精子活率高于0.3的保存時(shí)間。精子活率的檢測(cè)借助CASA系統(tǒng)進(jìn)行，每次試驗(yàn)做3組重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄，并采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋液對(duì)關(guān)中奶山羊精子活率的影響

由表2可知，精子在4 ℃條件低溫保存時(shí)，同種稀釋液中，精子活率隨著保存時(shí)間的增長(zhǎng)而降低；相同保存時(shí)間下，在試驗(yàn)前12 h，C組和E組精子活率顯著高于其他4組(P<0.05)，12 h后C組精子活率顯著高于其他5組(P<0.05)。

表2 不同稀釋液對(duì)關(guān)中奶山羊精子活率的影響

2.2 不同稀釋液對(duì)關(guān)中奶山羊精子存活時(shí)間的影響

由表3可知，在4 ℃環(huán)境下不同組別的稀釋液對(duì)精子存活時(shí)間的影響差異顯著，C組精子有效存活時(shí)間和總存活時(shí)間均顯著優(yōu)于其他5組(P<0.05)。

表3 不同稀釋液對(duì)關(guān)中奶山羊精子存活時(shí)間的影響

2.3 不同稀釋比例對(duì)關(guān)中奶山羊精子活率的影響

使用C組稀釋液對(duì)關(guān)中奶山羊進(jìn)行不同比例的稀釋。由表4可知，關(guān)中奶山羊精子在4 ℃條件低溫保存時(shí)，在試驗(yàn)前12 h，各組間精子活率差異不顯著；在18～60 h之間，以1∶4、1∶8的稀釋比例進(jìn)行稀釋的精液，精子活率情況較其他組有明顯優(yōu)勢(shì)，尤其隨時(shí)間增長(zhǎng)，精子活率顯著高于其他組(P<0.05)；在60 h之后，以1∶8的比例進(jìn)行稀釋的精液精子活率顯著高于稀釋比例為1∶4的一組(P<0.05)。

表4 不同稀釋比例對(duì)關(guān)中奶山羊精子活率的影響

2.4 不同稀釋比例對(duì)關(guān)中奶山羊精子存活時(shí)間的影響

由表5可知，在4 ℃環(huán)境下，使用C組稀釋液進(jìn)行稀釋后，不同稀釋比例對(duì)精子存活時(shí)間的影響差異顯著，其中以1∶8的比例進(jìn)行稀釋的精液，精子的有效存活時(shí)間和總存活時(shí)間均顯著優(yōu)于其他4組(P<0.05)。

表5 不同稀釋液對(duì)關(guān)中奶山羊精子存活時(shí)間的影響

3 討 論

精子活率是保證精子能順利通過雌性動(dòng)物生殖道與卵子結(jié)合成功受精的重要條件，稀釋后精子的有效存活時(shí)間是保證精子能進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間保存和運(yùn)輸?shù)闹匾獥l件，兩者是判斷稀釋液效果優(yōu)劣的重要指標(biāo)[7-8]。本次試驗(yàn)根據(jù)精子活率和有效存活時(shí)間對(duì)稀釋液效果進(jìn)行比較，可以看出C組稀釋液保存效果明顯優(yōu)于其他5組(P<0.05)，且稀釋比例為1∶8時(shí)精子的保存效果顯著優(yōu)于以其他比例進(jìn)行稀釋的4組。

隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子的代謝產(chǎn)物如乳酸和二氧化碳也不斷累積，精液的pH會(huì)有所降低，對(duì)精子造成酸損傷，精子的運(yùn)動(dòng)性能隨之下降，導(dǎo)致保存品質(zhì)同時(shí)下降[9]。而在稀釋液中選用穩(wěn)定的緩沖物質(zhì)能起到穩(wěn)定精液的pH的作用，有利于精液進(jìn)一步保存。王俊峰[10]研究認(rèn)為Tris作為冷凍稀釋液的緩沖物質(zhì)在綿羊的精液冷凍中起到很好的緩沖作用；施會(huì)彬等[11]使用以檸檬酸鈉為緩沖物質(zhì)的稀釋液在羊精子的低溫保存上取得較為突出的效果；薛昌安等[12]將Tris和檸檬酸配合使用，在山羊精液保存上效果突出。本試驗(yàn)中通過B組、C組和E組稀釋液效果的比較可以看出，以檸檬酸鈉作為主要緩沖物質(zhì)的C組稀釋液效果優(yōu)于以Tris作為緩沖物質(zhì)的B組以及使用Tris和檸檬酸鈉配合使用的E組稀釋液的效果。但緩沖物質(zhì)的最優(yōu)添加比例有待于進(jìn)一步探究。

卵黃是哺乳動(dòng)物精液稀釋液中重要的非滲透性保護(hù)劑。卵黃中含有的卵磷脂是保護(hù)精子的主要物質(zhì)。首先，其保護(hù)作用體現(xiàn)在對(duì)精子的能量供給方面，其次，卵黃中含有的卵磷脂融點(diǎn)較低，在進(jìn)入到精子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中后，能夠代替醛磷脂，具有在低溫環(huán)境下不易凍結(jié)的物性，因此能夠保護(hù)精子低溫條件下良好的生存[13-14]。但是在卵黃的使用方面仍存在問題，卵黃中可能存在的微生物增加了稀釋液被污染的危險(xiǎn)，卵黃成分過于復(fù)雜，且山羊精液中含有卵黃凝集，有資料報(bào)道卵黃凝集能與卵黃中卵磷脂發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生凝集，使用大豆卵磷脂代替卵黃效果更好[15]。本試驗(yàn)中通過C組和D組稀釋液效果的比較可以看出，卵黃在稀釋液中的使用效果明顯優(yōu)于大豆卵磷脂，這可能與大豆卵磷脂的溶解性有關(guān)。而通過A組和B組的對(duì)比可以看出在稀釋液中添加10%和15%的卵黃，短時(shí)間內(nèi)對(duì)精子活力的沒有顯著影響，在對(duì)精子存活時(shí)間的影響上，在稀釋液中添加15%卵黃優(yōu)于10%的卵黃，但是差異不顯著，這可能與隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子的能量損耗有關(guān)。

精液的稀釋比例對(duì)精液的長(zhǎng)期保存具有明顯的影響，稀釋比例較小，精子密度較大，隨著精子不斷代謝導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足精子的長(zhǎng)期存活，同時(shí)高密度的精液中精子互相碰撞也會(huì)造成一定的物理損傷，除此以外，高密度精子代謝產(chǎn)生的不利影響較大[16]。而精液稀釋比例過大，精子易受稀釋打擊，導(dǎo)致有效精子數(shù)降低，進(jìn)一步影響人工授精質(zhì)量[17]。劉福元等[18]研究表明，在薩福克羊精液低溫液態(tài)保存的過程中，以8倍稀釋后的精液的保存效果最佳；吐來力江·哈木太等[19]研究表明以5，10，15倍稀釋的精液保存效率最佳。而本次試驗(yàn)表明，在關(guān)中奶山羊的低溫保存過程中，以1∶8的比例進(jìn)行稀釋的精液保存效果最為突出，同時(shí)在48 h之內(nèi)以1∶4比例進(jìn)行稀釋的精液保存效果也比較突出，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用過程中，可以根據(jù)對(duì)精液密度的不同需求選擇(1∶4)～(1∶8)適當(dāng)?shù)南♂尡壤?/p>

4 結(jié) 論

通過本次試驗(yàn)出一組效果較為突出的關(guān)中奶山羊精液低溫保存稀釋液，其具體配方為：每100 mL稀釋液中添加無水葡萄糖3 g，乳糖4.8 g，檸檬酸鈉1.6 g，卵黃15 mL，青霉素和鏈霉素各10萬IU，同時(shí)在使用該稀釋液時(shí)的最佳稀釋比例為1∶8。