王丹丹，王 星，周翹楚

(遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118000)

紅光熊蜂(BombusignitesSmith)是一類(lèi)重要的傳粉昆蟲(chóng)，具嚼吸式口器，吻喙長(zhǎng)，接觸植物柱頭頻率高，除大顎可用作咀嚼或塑蠟外，中舌、小顎外葉和下唇須合并構(gòu)成復(fù)雜的食物管吸食花蜜。紅光熊蜂為典型的全變態(tài)社會(huì)性昆蟲(chóng)，具狹溫性[1-2]，生活溫度10～30 ℃，最適溫度25 ℃。低溫脅迫會(huì)影響其發(fā)育歷期，以及羽化后成蜂的死亡率、行為、外部形態(tài)和理化特性等，如翅脈發(fā)育、神經(jīng)突觸數(shù)量等，主要表現(xiàn)在糖、脂類(lèi)、氨基酸、嘌呤和硫胺素等代謝通路上相關(guān)基因的富集化差異表達(dá)[3]。

糖原合成酶(glycogen synthase，GS)為胰島素作用的關(guān)鍵酶，也為糖原生物合成過(guò)程中的限速酶，磷酸化GS失活，糖原被分解；去磷酸化GS被激活，糖原合成[4]。Akt由Akt1、Akt2和Akt3共3個(gè)亞型組成，序列同源率達(dá)85%，3個(gè)亞型生理功能各不相同，亦有重疊。其中Akt1缺失可導(dǎo)致胎盤(pán)營(yíng)養(yǎng)缺失、生長(zhǎng)發(fā)育延遲或體質(zhì)量下降；Akt2位于胰島素效應(yīng)組織中，參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，Akt2缺失可導(dǎo)致胰島素分泌或血糖異常；Akt3缺失可誘發(fā)大腦萎縮。Akt約有100 余種底物，參與機(jī)體多種信號(hào)通路，如通過(guò)調(diào)控FoxO亞家族蛋白或CREB等轉(zhuǎn)錄因子[5]，調(diào)控新陳代謝與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)；通過(guò)抑制Bcl-2家族的Bax、Bad等成員達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的[6]；通過(guò)調(diào)控Mtor參與蛋白質(zhì)合成、抗細(xì)胞調(diào)亡與保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能[7]；亦可通過(guò)磷酸化糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)，調(diào)控糖代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖以及細(xì)胞調(diào)亡等過(guò)程[8]?；罨腁kt2通過(guò)磷酸化多種酶及轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，如Akt磷酸化GSK3β而抑制其活性，促進(jìn)葡萄糖代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期；如GSK-3β為Akt2的底物，調(diào)控細(xì)胞的凋亡過(guò)程，即胰島素激活A(yù)kt2磷酸化GSK3β，使GSK3β失活，GS去磷酸化而被激活，糖原合成，反之糖原合成被抑制[9]。當(dāng)紅光熊蜂機(jī)體葡萄糖含量升高，胰島素通過(guò)激活PI3K/Akt通路刺激組織攝取葡萄糖，抑制GSK3β激酶活性，使GS去磷酸化，合成糖原，降低血糖含量，維持個(gè)體穩(wěn)態(tài)[10]。

溫度在動(dòng)物生存、繁殖、行為等方面具有深遠(yuǎn)的影響，目前為止，尚無(wú)研究從分子水平探討紅光熊蜂適應(yīng)低溫脅迫的防御機(jī)制。為了深入研究低溫脅迫對(duì)紅光熊蜂相關(guān)糖代謝基因的差異表達(dá)趨勢(shì)，本研究采用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆紅光熊蜂GS和Akt2基因全長(zhǎng)cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析不同溫度和不同時(shí)間低溫脅迫下，GS和Akt2基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，旨在探究紅光熊蜂在低溫環(huán)境下的防御機(jī)制，糖代謝通路特點(diǎn)及高糖狀態(tài)的形成機(jī)制，為培育抗寒紅光熊蜂奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取繁育旺盛、18日齡健康無(wú)病的紅光熊蜂(BombusignitesSmith)工蜂200只放入無(wú)光照、溫度25 ℃，相對(duì)濕度(relative humidity，RH)55%的恒溫恒濕箱(型號(hào)：HPX-160BS-Ⅱ)中培育5 d。將培養(yǎng)后的紅光熊蜂工蜂二等分，一部分分別置于RH 55%，溫度25，18，15，10，8，和5 ℃的低溫環(huán)境中培養(yǎng)2 d后取材，另一部分在RH 55%，8 ℃低溫下脅迫4，8，12，16，24，48和72 h后取材，對(duì)照組處理為RH 55%，8 ℃培養(yǎng)0 h，每個(gè)處理采用3只紅光熊蜂工蜂，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

將1.1節(jié)中不同低溫(5～25 ℃)培養(yǎng)以及8 ℃低溫脅迫不同時(shí)間的工蜂分別放入液氮研磨，按照Qiagen通用總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Universal Mini Kit)抽提總RNA，120 V、1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性；按照試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，4 ℃保存?zhèn)溆肹11-12]，每處理取3只工蜂，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 紅光熊蜂GS、Akt2基因全長(zhǎng)克隆

以意大利蜜蜂(GenBank登錄號(hào):XM_001120954.5)GS基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以1.2節(jié)中RH 55%，25 ℃培養(yǎng)的紅光熊蜂工蜂RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA第一鏈為模板，克隆紅光熊蜂GS基因核心序列。PCR反應(yīng)體系(20 μL)： cDNA 1 μL， LA緩沖液 (10×) 2.0 μL，dNTP Mix 3.0 μL，20 μmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μL LA聚合酶混合液0.5 μL，滅菌ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 本研究所用引物信息

以GS核心片段設(shè)計(jì)特異性引物，與GS 3’CDS引物按照SMARTerTMRACE cDNA Amplication試劑盒說(shuō)明書(shū)克隆紅光熊蜂GS基因3’端，反應(yīng)條件同上；紅光熊蜂Akt2基因全長(zhǎng)克隆步驟同GS基因。

1.4 紅光熊蜂GS、Akt2全長(zhǎng)基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)GS、Akt2基因全長(zhǎng)序列，采用ORF Finder預(yù)測(cè)基因開(kāi)放閱讀框；Prot Param在線軟件分析其理化特性；Prot Scale分析氨基酸序列的疏水性和親水性；SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[13]；GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blastp程序預(yù)測(cè)氨基酸保守域及同源性分析；采用TBtools軟件對(duì)GS、Akt2基因進(jìn)行染色體定位。

1.5 紅光熊蜂GS、Akt2互作蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

為驗(yàn)證紅光熊蜂GS、Akt2蛋白的生理作用及其代謝信號(hào)通路，采用在線軟件String(http://string-db.org/)構(gòu)建GS、Akt2蛋白的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置高可信度值為0.7。

1.6 紅光熊蜂GS、Akt2基因的低溫脅迫表達(dá)分析

1.6.1 不同溫度脅迫下GS、Akt2基因表達(dá)水平分析 采用Primer Premier 6設(shè)計(jì)特異性引物GS-qF/R與Akt2-qF/R，以GAPDHF/R為內(nèi)參引物(表1)，采用RTQ-960 Pro實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照TaKaRa試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅠ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析GS、Akt2基因在25，18，15，10，8和5 ℃培養(yǎng)下表達(dá)水平的差異。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA模板1.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，ddH2O加至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性10 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。每處理取3只工蜂，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6.2 低溫脅迫不同時(shí)間GS、Akt2基因表達(dá)水平分析 采用Primer Premier 6設(shè)計(jì)特異性引物GS-qF/R與Akt2-qF/R，以GAPDHF/R為內(nèi)參引物(表1)，采用RTQ-960 Pro實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照TaKaRa試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅠ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析GS、Akt2基因在8 ℃培養(yǎng)不同時(shí)間(0，4，8，12，16，24，48和72 h)的表達(dá)水平差異，探究紅光熊蜂低于生活溫度不出蜂房工作時(shí)，其機(jī)體對(duì)低溫刺激的反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.6.1節(jié)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)并制圖，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光熊蜂GS、Akt2基因克隆

以GS-cF/R為引物RT-PCR擴(kuò)增獲得892 bp基因片段，經(jīng)Blastp比對(duì)表明該片段編碼氨基酸與較多昆蟲(chóng)GS基因均具較高的同源性(85%～98%)，可見(jiàn)，擴(kuò)增得到的基因片段為紅光熊蜂GS基因核心序列?；贕S基因核心序列，進(jìn)行5’-RACE與3’-RACE PCR擴(kuò)增，分別得到378和197 bp的明亮條帶，采用SeqMan程序?qū)?’-RACE、核心序列與3’-RACE 3段DNA序列進(jìn)行拼接，獲得長(zhǎng)度為1 417 bp DNA片段，即GS基因(圖1-A)。

以Akt2-cF/R為引物RT-PCR擴(kuò)增獲得674 bp基因片段，經(jīng)Blastp比對(duì)表明該片段編碼氨基酸與較多昆蟲(chóng)Akt2基因均具較高的同源性(92%～96%)，可見(jiàn)，擴(kuò)增得到的基因片段為紅光熊蜂Akt2基因核心序列?；贏kt2基因核心序列，進(jìn)行5’-RACE與3’-RACE PCR擴(kuò)增，分別得到168和488 bp的明亮條帶，采用SeqMan程序?qū)?’-RACE、核心序列與3’-RACE 3段DNA序列進(jìn)行拼接，獲得長(zhǎng)度為926 bp DNA片段，即Akt2基因(圖1-B)。

A.GS基因克隆;B.Akt2基因克隆

2.2 紅光熊蜂GS、Akt2基因序列分析

紅光熊蜂GS基因全長(zhǎng)為1 417 bp，包含一個(gè)1 020 bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼339個(gè)氨基酸，其5’-UTR 291 bp，3’-UTR 106 bp(圖2)。

Prot Param分析表明，GS蛋白分子式為C1594H2530N530O494S9，分子相對(duì)質(zhì)量為37.31 ku，等電點(diǎn)(pI)為8.31，脂肪系數(shù)61.56。Prot Scale分析表明GS蛋白為親水性蛋白；PSORT Prediction亞細(xì)胞定位該蛋白可能存在于線粒體中；SOPMA預(yù)測(cè)GS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括無(wú)規(guī)則卷曲(51.92%)、α-螺旋(23.89%)、延伸鏈(12.09%)和β-轉(zhuǎn)角(12.09%)；NetPhos 3.1預(yù)測(cè)其具有12個(gè)Ser、6個(gè)Thr、2個(gè)Tyr，可能成為GS蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。

紅光熊蜂Akt2基因全長(zhǎng)為926 bp，ORF為837 bp，編碼278個(gè)氨基酸，其5’-UTR 48 bp， 3’-UTR 57 bp(圖3)。Prot Param 分析表明，Akt2蛋白質(zhì)分子式為C1427H2227N369O423S13，分子相對(duì)質(zhì)量為31.74 ku，等電點(diǎn)(pI)為5.29，脂肪系數(shù)89.42；Prot Scale分析表明Akt2蛋白為親水性蛋白。PSORT Prediction亞細(xì)胞定位該蛋白可能存在于細(xì)胞核或線粒體中；SOPMA預(yù)測(cè)Akt2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括無(wú)規(guī)則卷曲(33.45%)、α-螺旋(34.89%)、延伸鏈(23.74%)和β-轉(zhuǎn)角(7.91%)；NetPhos 3.1預(yù)測(cè)其具有7個(gè)Ser、8個(gè)Thr、5個(gè)Tyr，可能成為Akt2蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。

SignalP4.1 在線預(yù)測(cè)紅光熊蜂GS、Akt2蛋白均不具信號(hào)肽序列，故二者均為非分泌蛋白。染色體定位結(jié)果顯示，GS、Akt2基因分別分布在紅光熊蜂1H和3H號(hào)染色體上。

2.3 紅光熊蜂GS、Akt2互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

為驗(yàn)證紅光熊蜂GS、Akt2蛋白的生理作用，采用在線軟件String(http://string-db.org/)搜索互作蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果顯示與GS、Akt2互作的蛋白質(zhì)共有9個(gè)(圖4)，即：糖原合成酶激酶-3β、叉頭轉(zhuǎn)錄因子、絲/蘇氨酸蛋白激酶、4,5-二磷酸磷脂酰肌醇3激酶、磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1、促分裂素原活化蛋白激酶5、TBC1結(jié)構(gòu)域家族蛋白成員4等，這些蛋白均為PI3K/Akt/Mtor、PI3K/Akt/Mtor以及PI3K/Akt/Foxo信號(hào)通路的重要蛋白酶類(lèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。GS直接參與糖原合成與分解過(guò)程，Akt2是胰島素信號(hào)通路中重要的蛋白激酶，調(diào)控糖代謝過(guò)程，當(dāng)個(gè)體處于低溫刺激時(shí)可抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)控機(jī)體累積大量抗凍保護(hù)物質(zhì)葡萄糖以抵御低溫?fù)p傷，可見(jiàn)，GS、Akt2是紅光熊蜂低溫脅迫糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。

Gsk3b.糖原合成酶激酶-3β；Gs.糖原合酶；Foxo3.叉頭轉(zhuǎn)錄因子3；Foxo1.叉頭轉(zhuǎn)錄因子1；Mtor.絲/蘇氨酸蛋白激酶；Tsc2.抑癌基因2；Pik3ca.4,5-二磷酸磷脂酰肌醇3激酶；Pdpk1.磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1；Map3k5.促分裂素原活化蛋白激酶5；Tbc1d4.TBC1結(jié)構(gòu)域家族蛋白成員4

2.4 紅光熊蜂GS、Akt2基因低溫脅迫表達(dá)分析

2.4.1 不同溫度脅迫下GS、Akt2基因的表達(dá)水平 不同溫度脅迫下紅光熊蜂GS、Akt2基因的相對(duì)表達(dá)量如圖5所示。

由圖5可知，GS基因的相對(duì)表達(dá)量隨溫度降低呈下降趨勢(shì)，15 ℃時(shí)表達(dá)量下降顯著，5 ℃時(shí)表達(dá)量是25 ℃的16.1 %；而紅光熊蜂Akt2基因表達(dá)水平隨溫度降低呈明顯上升趨勢(shì)，15 ℃時(shí)Akt2基因的表達(dá)量顯著升高，5 ℃達(dá)到峰值，約為25 ℃時(shí)表達(dá)量的3.7倍，推測(cè)紅光熊蜂為適應(yīng)低溫環(huán)境，機(jī)體通過(guò)糖原合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶GS限制糖原的合成，使機(jī)體呈高糖狀態(tài)，這種高糖狀態(tài)源自于糖原降解，即通過(guò)抑制GS活性，促進(jìn)GP活性，導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖積累，因此，低溫環(huán)境下GS表達(dá)一直處于較低水平，說(shuō)明低溫條件下紅光熊蜂機(jī)體可產(chǎn)生大量葡萄糖作為抗凍物質(zhì)，保護(hù)自身免受低溫?fù)p傷，對(duì)紅光熊蜂抵御低溫環(huán)境起重要作用。

2.4.2 低溫脅迫不同時(shí)間GS、Akt2基因的表達(dá)水平 紅光熊蜂生活溫度為10～30 ℃，溫度低于10 ℃便不出蜂房工作，本研究探究低于生活溫度時(shí)，紅光熊蜂機(jī)體對(duì)低溫刺激的反應(yīng)。圖6為8 ℃低溫處理不同時(shí)間紅光熊蜂GS、Akt2基因的相對(duì)表達(dá)量。由圖6可知，與對(duì)照(0 h)相比，8 ℃脅迫8 h 時(shí)GS基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降；脅迫12 h相對(duì)表達(dá)量最低，約為對(duì)照組的11%；脅迫12 h后GS相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的增加有所回升，24 h后基本平穩(wěn)，表明低溫脅迫下紅光熊蜂GS基因相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先顯著下降后緩慢上升逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。8 ℃低溫脅迫下，紅光熊蜂Akt2基因表達(dá)水平隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照(0 h)相比，脅迫4 h時(shí)Akt2基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高，12 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的1.7倍，隨后其相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)緩慢下降，脅迫72 h時(shí)基本恢復(fù)正常水平，說(shuō)明在遇到低溫刺激時(shí)，紅光熊蜂機(jī)體快速做出應(yīng)答反應(yīng)，但可通過(guò)自身調(diào)節(jié)恢復(fù)且維持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖6 低溫脅迫不同時(shí)間紅光熊蜂GS、Akt2基因表達(dá)量變化

3 討 論

3.1 低溫脅迫對(duì)紅光熊蜂的危害

紅光熊蜂是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的傳粉昆蟲(chóng)，其傳粉能力遠(yuǎn)超過(guò)蜜蜂，所以熊蜂采蜜是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的重要渠道[14]。蜂群耐低溫脅迫或安全越冬對(duì)第二年熊蜂的生產(chǎn)、作物產(chǎn)量至關(guān)重要。低溫冷害一直作為嚴(yán)峻的非生物逆境脅迫影響著紅光熊蜂的壽命，溫度低于10 ℃紅光熊蜂便不出蜂房工作，所以，了解紅光熊蜂耐低溫脅迫的生理機(jī)制及生存策略對(duì)保護(hù)和培育抗寒蜂種至關(guān)重要[15]。低溫環(huán)境對(duì)昆蟲(chóng)身體各器官及其新陳代謝水平影響較大，如低溫脅迫下，昆蟲(chóng)機(jī)體新陳代謝水平顯著下降，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用、缺氧缺血、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜流動(dòng)性均會(huì)發(fā)生改變，昆蟲(chóng)則通過(guò)減慢代謝水平來(lái)降低能量的消耗，也可通過(guò)提高或降低糖代謝相關(guān)基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)量(如GS、Akt基因)來(lái)抵御低溫脅迫[16]。低溫脅迫時(shí)體液結(jié)冰，器官遭物理壓迫，而自由水是維持生命正常新陳代謝不可或缺的物質(zhì)，當(dāng)紅光熊蜂體溫低于體液的冰點(diǎn)溫度時(shí)，滲透壓降低，致使細(xì)胞內(nèi)液外流，自由水含量顯著下降，細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，新陳代謝紊亂，機(jī)體處于低代謝缺氧狀態(tài)，造成氧化損傷[17-18]，可見(jiàn)，細(xì)胞產(chǎn)生冰晶不但損傷機(jī)體細(xì)胞，形成氧化損傷，亦可產(chǎn)生溶質(zhì)中毒現(xiàn)象威脅紅光熊蜂的生存。研究表明，昆蟲(chóng)在低溫環(huán)境下能夠自我提高體內(nèi)結(jié)合水的含量，同時(shí)降低自由水含量，以避免體液結(jié)冰，而紅光熊蜂體內(nèi)葡萄糖、游離水含量的增加可提高過(guò)冷卻點(diǎn)溫度。過(guò)冷卻現(xiàn)象是低溫狀態(tài)下紅光熊蜂體內(nèi)抗寒物質(zhì)所表現(xiàn)出來(lái)的一種抵御低溫環(huán)境的生理現(xiàn)象，過(guò)冷卻點(diǎn)越低，表明昆蟲(chóng)的抗寒能力越強(qiáng)[19]。

3.2 紅光熊蜂抵御低溫的分子機(jī)制

糖原是動(dòng)物體內(nèi)儲(chǔ)存葡萄糖的一種形式，由多個(gè)葡萄糖組成的生物大分子，低溫脅迫下，糖原分解葡萄糖來(lái)維持血液中的葡萄糖含量，為機(jī)體新陳代謝提供能量，而機(jī)體內(nèi)過(guò)多的葡萄糖按能量代謝方式轉(zhuǎn)化為糖原儲(chǔ)存在紅光熊蜂體內(nèi)，以確保在逆境脅迫下維持其機(jī)體正常的生命活動(dòng)[20-21]。本研究分析了8 ℃低溫脅迫下紅光熊蜂GS基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，脅迫4 h 時(shí)GS基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降，12 h相對(duì)表達(dá)量最低，約為對(duì)照組的11%，而后GS相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)有所回升，24 h后基本平穩(wěn)，推測(cè)紅光熊蜂為適應(yīng)低溫脅迫，機(jī)體通過(guò)降低糖原合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶GS表達(dá)水平來(lái)抑制糖原合成，使機(jī)體產(chǎn)生大量葡萄糖提供能量，以提高過(guò)冷卻點(diǎn)溫度抵御低溫，葡萄糖的產(chǎn)生來(lái)源于機(jī)體糖原降解，即通過(guò)抑制GS活性，促進(jìn)糖原磷酸酶(glycogen phosphorylase,GP)的活性，導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖大量積累，體內(nèi)葡萄糖含量與溫度降低呈正相關(guān)，即溫度越低體內(nèi)葡萄糖含量越高[22-23]。低溫脅迫下，紅光熊蜂Akt2基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后降低的趨勢(shì)，脅迫4 h時(shí)Akt2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，12 h達(dá)到峰值，約為對(duì)照的1.7倍，而后通過(guò)自身調(diào)節(jié)，其相對(duì)表達(dá)量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)緩慢下降，72 h基本恢復(fù)正常水平。Akt2屬于胰島素信號(hào)通路中的重要激酶，低溫脅迫下，Akt通過(guò)調(diào)節(jié)下游分子GSK3β和GS活性，降解和轉(zhuǎn)化糖原產(chǎn)生大量葡萄糖來(lái)維持機(jī)體血糖平衡抵御低溫[24]。按照PI3K-Akt信號(hào)通路原理，Akt2磷酸化GSK3β后，抑制了GSK3β的活性，而促進(jìn)GS活性，GS基因的表達(dá)量應(yīng)該隨著Akt2上調(diào)，但事實(shí)GS基因的表達(dá)量卻是下調(diào)，說(shuō)明其不僅僅是調(diào)控糖代謝，也可通過(guò)PI3K/Akt/Mtor、PI3K/Akt/Mtor以及PI3K/Akt/Foxo等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)Mtor參與抗凍蛋白質(zhì)合成、調(diào)控Bad等，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞調(diào)亡或通過(guò)調(diào)節(jié)FoxO亞家族調(diào)控能量代謝等過(guò)程，如PI3K- AKT - FoxO1信號(hào)通路中FoxO1作為機(jī)體調(diào)控代謝的重要因子，受胰島素負(fù)調(diào)控，胰島素缺乏時(shí)，F(xiàn)oxO1集中于細(xì)胞核，啟動(dòng)靶基因胰島素反應(yīng)元件(insulin response element,IRE)的表達(dá)促進(jìn)糖異生；胰島素充足時(shí)，F(xiàn)oxO1激活PI3K-AKT通路，導(dǎo)致下游分子AKT磷酸化活化，進(jìn)而使FoxO1磷酸化從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì)失去活性[25]。與Xu等[26]研究結(jié)果一致，即在0 ℃低溫脅迫下，中華蜜蜂(Apisceranacerana)成蜂(20日齡)與生態(tài)環(huán)境相關(guān)的Ca2+信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路，及其絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、熱激蛋白以及鋅指蛋白等均存在顯著的差異表達(dá)現(xiàn)象?？梢?jiàn)，在低溫脅迫過(guò)程中Akt2參與多種信號(hào)通路行使多種功能，以達(dá)到紅光熊蜂抵抗低溫傷害的目的。此外，紅光熊蜂GS、Akt2基因在15 ℃時(shí)表達(dá)量波動(dòng)較大，相對(duì)其體溫波動(dòng)也很大，推測(cè)15 ℃是紅光熊蜂體溫調(diào)節(jié)的臨界值，可能與紅光熊蜂的能量代謝密切相關(guān)。