于永昂，睢曉湉，張 蕾，張夏冰

(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控是維持細胞基因調(diào)控完整性的基本步驟，在植物生長發(fā)育、抵御生物脅迫和非生物脅迫中起著至關(guān)重要的作用[1-3]。植物在生長過程中會受到生物脅迫(病原菌侵入、病蟲害等)和非生物脅迫(高溫、高鹽、干旱等)的影響，從而抑制其生長發(fā)育，造成各種作物質(zhì)量、產(chǎn)量的下降，給人類生產(chǎn)帶來極大危害[4-5]。當(dāng)受到逆境脅迫時，植物胞外的信號(高溫、高鹽、干旱、病原菌等)通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑級聯(lián)放大進入植物細胞核內(nèi)，通過與其他防御相關(guān)蛋白的相互作用，激活或抑制下游相關(guān)防御基因的轉(zhuǎn)錄，從而響應(yīng)植物對相關(guān)逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子MYC(myelocytomatosis)、NAC(NAM、ATAF1/2和CUC1/2)、ERF(ethylene responsive factor)、bZIP(basic region/leucine zipper)、WRKY 等在這一系列調(diào)控中起到非常重要的作用。其中，WRKY是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[6]。WRKY最先從甘薯中分離[7]，目前至少20種植物中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY，其可以參與生物和非生物脅迫的應(yīng)答響應(yīng)，如植物生長、發(fā)育、代謝、環(huán)境信號刺激及對病原菌的防御反應(yīng)和抗病途徑調(diào)控等重要的生物發(fā)育過程[8]。最典型的特點是其N端含有DNA結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域高度保守，由約60個氨基酸組成WRKY結(jié)構(gòu)域；C端具有Cys(2)-His(2)或Cys(2)-HisCys的鋅指結(jié)構(gòu)[9-10]。擬南芥AtWRKY25/26受到高鹽、高溫及滲透脅迫的誘導(dǎo)[11]，AtWRKY57能通過激活與ABA相關(guān)基因的表達增強擬南芥的耐干旱能力[12]。將玉米ZmWRKY40基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)過表達擬南芥的過氧化物酶(POD)和 CAT活性提高， 活性氧(ROS)含量降低，進而增強了轉(zhuǎn)基因株系的抗旱性，進一步分析發(fā)現(xiàn)ZmWRKY40基因表達受到干旱、鹽害、高溫和ABA誘導(dǎo)[13]。Zhu[14]等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄VvWRKY30基因的表達受鹽脅迫誘導(dǎo)，能夠增強轉(zhuǎn)基因植株對NaCl的抗性。研究表明，普通小麥基因組中至少含有200個WRKY基因[15]，但目前僅有少數(shù)成員的功能被鑒定，其中TaWRKY10、TaWRKY44參與多種非生物脅迫逆境的應(yīng)答，過表達能夠增強植物的抗旱性[16]。Niu等[17]在小麥cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了43個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其中TaWRKY2受干旱、鹽和 ABA誘導(dǎo)表達，過表達TaWRKY2能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性和耐鹽性。He等[18]研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaWRKY1和TaWRKY33能夠激活下游脅迫相關(guān)基因的表達，脫水處理時TaWRKY1和TaWRKY33轉(zhuǎn)基因擬南芥脫水率較對照降低，且TaWRKY33還可以響應(yīng)高溫脅迫。雖然目前在小麥中已有多個WRKY轉(zhuǎn)錄因子報道，但與模式植物擬南芥和水稻相比，其抗逆性機理還不十分清楚。

為此，本研究從小麥百農(nóng)207葉片中分離鑒定了TaWRKY28基因，利用生物信息學(xué)工具對其編碼蛋白的理化特性進行系統(tǒng)分析；采用qRT-PCR技術(shù)分析NaCl、ABA、H2O2、干旱和低溫等非生物逆境脅迫下TaWRKY28基因的表達水平，通過農(nóng)桿菌浸染法將TaWRKY28轉(zhuǎn)化至模式植物擬南芥，研究模式植物生理指標(biāo)及其功能，為進一步探究TaWRKY28基因在非生物脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為普通小麥品種百農(nóng)207，由河南科技學(xué)院小麥遺傳改良中心保存。挑取飽滿一致的小麥種子置培養(yǎng)皿濾紙上萌發(fā)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照16/8 h(晝/夜)，相對濕度75%，至三葉一心期取長勢一致的小麥幼苗分別進行NaCl(100 mmol/L)、ABA(100 μmol/L)、H2O2(100 μmol/L) 、干旱(6% PEG-6000)和低溫(4 ℃)處理，處理0，2，4，6，8和12 h后，取小麥幼苗葉片，并以正常生長幼苗為對照，將處理后樣品在液氮中速凍后置于-80 ℃保存，用于分析目標(biāo)基因逆境脅迫條件下的表達模式。取正常生長的小麥根、莖、葉、雌蕊和雄蕊，于-80 ℃保存，用于目標(biāo)基因的組織表達模式分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 小麥總RNA的提取采用TIANGEN公司試劑盒, 按照TIANGEN公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA第一鏈合成，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2TaWRKY28基因克隆 根據(jù)小麥WRKY28基因序列(GenBank登錄號：AK456622)，設(shè)計用于PCR擴增的特異性引物TaWRKY28-F和TaWRKY28-R(表1)。以小麥正常生長葉片c-DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)?；厥占兓?，用pMD19-T載體連接目的片段，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，隨后挑取陽性克隆送華大基因公司測序。

表1 本研究所用引物序列

1.2.3 TaWRKY28生物信息學(xué)分析 利用ProtParam(ExPASy)在線分析軟件分析TaWRKY28蛋白的理化性質(zhì)，利用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)，通過PlantCARE(http://bioinformatics.Psb.Ugent.be/webtools/plant-care/html/)網(wǎng)站預(yù)測順式作用元件，通過Blast進行基因序列同源性比對分析，利用Clustral W和DNAMAN軟件對氨基酸序列進行比對與分析，采用Mega 5.0軟件Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.4 TaWRKY28亞細胞定位 根據(jù)克隆得到的TaWRKY28基因序列設(shè)計引物GFP-TaWRKY28-F和GFP-TaWRKY28-R(表1)，擴增帶有酶切位點(XbaⅠ和BamH Ⅰ)TaWRKY28的ORF全長，PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切，與相同酶切的pBI121-GFP載體經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂板挑斑進行PCR鑒定，挑選陽性菌液抽提質(zhì)粒后進行酶切鑒定，將酶切鑒定成功的質(zhì)粒送華大基因公司測序，將測序正確的質(zhì)粒，命名為pBI121-TaWRKY28-GFP。將構(gòu)建好的載體以及空載體pBI121-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101后浸染洋蔥表皮細胞，48 h后置于載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5TaWRKY28基因的表達 為了研究TaWRKY的組織表達和逆境脅迫下的表達模式，按照試劑盒說明書提取1.1節(jié)中保存的小麥不同組織(根、莖、葉、雌蕊和雄蕊)及不同脅迫(NaCl,ABA,H2O2,干旱和低溫)處理不同時間(0，2，4，6，8，12 h)的小麥總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)克隆的TaWRKY28基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物qRT-TaWRKY28-F和qRT-TaWRKY28-R(表1)，以小麥Actin為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR分析。用UltraSYBR Mixture(with ROX)試劑盒(康為世紀(jì))進行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系:2×UltraSYBR混合液10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加水補足20 μL。擴增程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進行定量數(shù)據(jù)分析。

1.2.6TaWRKY28轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得 以TaWRKY28基因序列為模板，OE-TaWRKY28-F和OE-TaWRKY28-R(表1)為引物進行目的基因PCR擴增。將PCR產(chǎn)物與pCAMBIA1301載體(酶切位點為XbaⅠ和BamH Ⅰ)連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，菌落PCR鑒定后擴大培養(yǎng)。采用浸染法對野生型擬南芥Col-0進行轉(zhuǎn)化，經(jīng)潮霉素抗性篩選后收獲單株，同樣的方法繼續(xù)篩選直至T3，該株系即為純合轉(zhuǎn)基因株系。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaWRKY28基因克隆

以正常生長小麥幼苗葉片cDNA為模板進行

PCR擴增，擴增結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，在1 000 bp左右處可見一條清晰的條帶。切膠回收后連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)過菌落PCR篩選陽性克隆，對鑒定的陽性克隆進行測序。

M.DL5000 Marker;1.TaWRKY28基因

2.2 TaWRKY28生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)驗證發(fā)現(xiàn)，獲得的TaWRKY28基因片段長度為1 004 bp，ORF為978 bp，編碼325個氨基酸(圖2)。

圖2 TaWRKY28基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

預(yù)測該蛋白等電點為9.27，相對分子質(zhì)量為34.87 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為47.25，屬于不穩(wěn)定蛋白。在組成TaWRKY28蛋白的所有氨基酸中，丙氨酸(Ala)比例最高，為總氨基酸量的13.5%；異亮氨酸(lle)和色氨酸(Trp)比例最低，分別為總氨基酸量的0.9%和0.6%；其含有35個負電性氨基酸殘基(Asp+Glu)，44個正電性氨基酸殘基(Arg+Lys);脂肪族氨基酸指數(shù)68.31。ProtParam在線軟件分析該蛋白的平均疏水指數(shù)為-0.541，為疏水性蛋白。

通過Blastp工具查找TaWRKY28蛋白的同源氨基酸序列，選取6個不同物種的WRKY氨基酸序列，分別為二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,XP_003563320)、水稻(Oryzasativa,DAA05093)、玉米(Zeamays,XP_008659853)、大麥(Hordeumvulgare,AGM37860)、高粱(Sorghumbicolor,XP_002437362)和谷子(Setariaitalica,XP_004965726)，利用DNAMAN軟件將TaWRKY28與其他物種氨基酸序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列含有WRKY家族典型的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域，同時含有1個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，因此屬于Ⅱ型WRKY轉(zhuǎn)錄因子(圖 3)。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果(圖4)表明，小麥TaWRKY28與大麥HvWRKY2在同一分支上且遺傳距離較近，與玉米ZmWRKY1和毛白楊PtWRKY7的遺傳距離較遠。

圖3 TaWRKY28與其他物種WRKY蛋白序列多重比較結(jié)果

圖4 TaWRKY28與其他植物同源WRKY蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

2.3 TaWRKY28蛋白亞細胞定位

構(gòu)建pBI121-TaWRKY28-GFP載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸染方法將其轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細胞中，同時用轉(zhuǎn)化不含目的基因的空載體pBI121-GFP作為對照，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空載體pBI121-GFP在洋蔥表皮細胞的細胞膜和細胞核都有綠色熒光，而pBI121-TaWRKY28-GFP只在洋蔥表皮細胞的細胞核內(nèi)有綠色熒光，表明TaWRKY28基因編碼蛋白定位于細胞核(圖5)。

圖5 TaWRKY28蛋白亞細胞定位

2.4 TaWRKY28基因的表達分析

qRT-PCR分析結(jié)果(圖6)表明，在正常生長小麥的根、莖、葉、雄蕊和雌蕊中均可檢測到TaWRKY28的表達，但不同組織表達程度不同。其中，TaWRKY28在葉中相對表達量最高，雄蕊中次之，雌蕊中表達量最低，且TaWRKY28在葉片和雄蕊中的相對表達量顯著高于其他組織。

*表示在 0.05 水平下組織間差異顯著

從圖7可知，所有脅迫處理下，TaWRKY28的相對表達量均隨脅迫時間的延長呈先上升后下降的變化趨勢，只是不同處理相對表達量的最高點出現(xiàn)時間不同而已。在NaCl和ABA脅迫處理下，均在處理4 h時TaWRKY28的相對表達量達到最高；H2O2脅迫處理6 h時相對表達量達到最高值；低溫處理4 h時相對表達量達到最高值；干旱處理2 h時TaWRKY28基因表達量最高，而在8 h時后表達量明顯降低。

*與**分別表示同一處理不同處理時間在0.05和0.01水平下差異顯著。下同

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達量分析

qRT-PCR結(jié)果(圖8)表明，與野生型(WT)相比，6個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(L1、L2、L3、L4、L5和L6)的相對表達量均極顯著提高，其中L1、L3、L6相對表達量更高。

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株TaWRKY28基因的相對表達量

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性鑒定

A.轉(zhuǎn)TaWRKY28基因擬南芥植株和野生型(WT)干旱脅迫表型；B.干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和野生型(WT)擬南芥植株葉片的DAB和NBT染色結(jié)果

由圖10可以看出，在正常情況下，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系SOD和POD活性無明顯差異；干旱脅迫處理21 d后，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系SOD和POD活性均極顯著高于野生型擬南芥(圖10-A-B)。這表明過表達TaWRKY28基因能夠提高擬南芥保護酶活性，進而增強擬南芥植株抗氧化能力。在正常情況下，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系H2O2、脯氨酸和丙二醛(MDA)含量均無明顯差異；干旱脅迫21 d后，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系H2O2和MDA含量極顯著和顯著低于野生型植株，而脯氨酸含量極顯著高于野生型擬南芥(圖10-C-E)。

圖10 轉(zhuǎn)TaWRKY28基因擬南芥植株生理指標(biāo)分析

3 討 論

綜上所述，本研究采用RT-PCR成功分離得到能夠響應(yīng)干旱脅迫的小麥TaWRKY28基因，過表達該基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱能力，為進一步利用該基因提高小麥抗旱性奠定了理論基礎(chǔ)。