張倩玉，王磊，于盟盟，梁娟

（日照市海洋與漁業(yè)研究院，山東 日照 276826）

氯霉素是一種高效廣譜的抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用，曾被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。但氯霉素對人體有較強(qiáng)的毒副作用，長期食用氯霉素殘留量超標(biāo)的水產(chǎn)品，可引起人肝臟和骨髓造血機(jī)能的損害，導(dǎo)致再生障礙性貧血和血小板減少、肝損傷等病癥。此外，氯霉素還會引起腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致消化機(jī)能紊亂。歐美等發(fā)達(dá)國家及中國先后頒布了禁止在動物源性食品中使用此類藥物的禁令。

目前，氯霉素殘留量的檢測方法主要有：氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附法等。酶聯(lián)免疫吸附法由于其抗原抗體的活性易受到溫度、濕度和試劑盒批次的影響，重現(xiàn)性較差，只適用于大批量樣品的篩選，不能用于定量；液相色譜法的靈敏度則達(dá)不到測定要求；氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法的樣品前處理過程繁瑣，耗時長，易出現(xiàn)回收率較低的問題；高效液相色譜-質(zhì)譜法樣品前處理過程簡單，重現(xiàn)性好，靈敏度高，是測定氯霉素的首選方法?，F(xiàn)在文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上，對樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，利用超聲提取和內(nèi)標(biāo)法定量。優(yōu)化后的測定方法適用于刺參、大菱鲆、南美白對蝦、三疣梭子蟹、鯉等水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的快速測定，該方法回收率和靈敏度均滿足測定要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 液相色譜儀、Agilent 6460A 三重四級桿質(zhì)譜儀（均為安捷倫科技有限公司）；PL202-L電子精密天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；SQP 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TG16-WS 臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；渦旋混合器（美國Talboys 公司）；超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；水浴氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；超純水器（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）。

乙酸乙酯、正己烷、甲醇（色譜純，美國ACS）；氯霉素、氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；氫氧化銨（25%~28%，優(yōu)級純，西隴化工股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濃度為100 mg/L，配制方法為準(zhǔn)確稱?。?0.0±0.1）mg 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 mL，-18 ℃保存。中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為20 μg/L，配制方法為移取10 μL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋定容至50 mL。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品提取

大菱鲆、刺參、南美白對蝦、三疣梭子蟹和鯉均取自日照當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場。

分別稱取經(jīng)絞碎后的大菱鲆、刺參、南美白對蝦、三疣梭子蟹、鯉樣品5.00 g 于50 mL 聚丙烯離心管中，依次加入0.20 mL 濃度為100 μg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液、0.45 mL 氫氧化銨和25 mL 乙酸乙酯，渦旋混合 30 s，超聲提取 30 min，4 000 r/min 離心 5 min。移取5 mL 上清液于10 mL 離心管中，于45~55 ℃水浴中氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.2 凈化

向離心管中加入1 mL 甲醇水溶液［V（甲醇）∶V（水）=70∶30］溶解殘留物，加入 2~3 mL 正己烷，渦旋1 min，6 000 r/min 離心 5 min，移去上層正己烷，取下層溶液過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3 液相色譜及質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C柱，規(guī)格為2.1 mm×50 mm，粒度 1.8 μm，流量 0.3 mL/min，柱溫 35 ℃。進(jìn)樣量20 μL。流動相為甲醇水溶液[V（甲醇）∶V（水）=70∶30]。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式為ESI-，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流量11 mL/min，霧化器壓力45 310.26 kPa，毛細(xì)管電壓4 000 V，增益電壓Delta EMV（-）200 V，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測離子對及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

在樣品中加入適量乙酸乙酯后進(jìn)行超聲提取，與文獻(xiàn)[7]中采用勻質(zhì)器勻質(zhì)提取相比，該操作簡單，可避免在處理批量樣品時因刀頭清洗不徹底導(dǎo)致的交叉污染。由于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀一次只能濃縮一個樣品，而氮吹儀可同時濃縮24 個樣品，縮短了大批量樣品前處理的時間，因此濃縮時采用水浴氮吹代替旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用ZORBAX SB-C色譜柱進(jìn)行分離，對V（甲醇）∶V（水）進(jìn)行優(yōu)化，分別在比例為 90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50 條件下測定，綜合考慮氯霉素的響應(yīng)值和峰型，選擇的流動相比例為V（甲醇）∶V（水）=70∶30。

在ESI-模式下，先進(jìn)行全掃描，確定目標(biāo)化合物離子質(zhì)量數(shù)，同時對毛細(xì)管出口電壓進(jìn)行優(yōu)化；再采用子離子掃描，確定定性離子和定量離子，并對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。在多反應(yīng)監(jiān)測（Multi reaction monitor, MRM）模式下，對目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和定量分析。在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，空白大菱鲆樣品中添加0.5 μg/kg氯霉素時，定量離子和內(nèi)標(biāo)化合物 MRM 圖見圖 1（a）（b）。

圖1 空白大菱鲆樣品中添加0.5 μg/kg 氯霉素時定量離子和內(nèi)標(biāo)化合物的MRM 圖

2.3 線性范圍及檢出限

分別移取適量中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為 0.1，0.5，1.0，2.5 和 5.0 μg/L 的溶液，在上述色譜和質(zhì)譜條件下測定，以外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，響應(yīng)比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3 倍信噪比（3 S/N）計(jì)算檢出限。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。結(jié)果顯示，氯霉素在質(zhì)量濃度0.1~5.0 μg/L 內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)滿足理化檢測的要求（>0.99）。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 方法回收率和精密度

向未檢出目標(biāo)物的樣品中分別添加0.1，0.2 和1.0 μg/kg 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平的添加量平行測定6 次，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3，氯霉素回收率為92.0%~98.6%，RSD 為3.0%~5.1%，滿足測定要求。

表3 方法回收率和精密度結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

對氯霉素殘留量的測定標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了優(yōu)化。水產(chǎn)品樣品在堿性條件下，以乙酸乙酯為提取液，以超聲提取代替勻質(zhì)提取，濃縮時采用水浴氮吹代替旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，提高了檢測效率。同時采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量，確保了方法的回收率和準(zhǔn)確度。本方法操作簡單，靈敏度、回收率和精密度等方法學(xué)指標(biāo)均能滿足水產(chǎn)品中氯霉素的檢測要求，適用于鮮活水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的批量測定。