脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT/CD36）是一種促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸（LCFAs）攝取和氧化的跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。該蛋白是一種多功能的B類清道夫受體，作為脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在脂質(zhì)代謝、胰島素反應(yīng)和炎癥中發(fā)揮重要作用，并參與代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制，如肥胖、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪性肝病。代謝綜合征也被稱為“胰島素抵抗綜合征”，胰島素抵抗是代謝綜合征的核心組成部分，是代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理因素。

使網(wǎng)絡(luò)中的f×n個(gè)協(xié)同成員節(jié)點(diǎn)失效，f∈[0,1]為協(xié)同成員節(jié)點(diǎn)的失效比例，同時(shí)記錄CPIKN結(jié)構(gòu)與效能穩(wěn)定性指標(biāo)的變化情況。

CD36異常高表達(dá)可促進(jìn)代謝綜合征和胰島素抵抗的發(fā)生。目前CD36基因缺失對(duì)胰島素抵抗的影響尚存爭(zhēng)議，這極大的限制了以CD36作為代謝綜合征干預(yù)靶點(diǎn)的藥物研發(fā)。有研究表明，缺乏CD36基因可以保護(hù)小鼠免受高脂飲食引起的肥胖、高血糖和胰島素抵抗。相反的是，遺傳性CD36基因缺陷患者在亞洲和非洲人群中較為常見(jiàn)，CD36基因缺陷患者全身葡萄糖攝取降低，同時(shí)患者還表現(xiàn)出高脂血癥、代謝綜合征癥狀和胰島素抵抗。大型的隊(duì)列研究也顯示CD36基因表達(dá)降低與胰島素抵抗和2 型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。CD36基因缺失改善或者加重胰島素抵抗受什么因素的影響仍然是未知的。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失可改善高脂誘導(dǎo)的脂代謝紊亂和胰島素抵抗，而在正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失反而會(huì)削弱生理的胰島素敏感性。這表明CD36對(duì)胰島素抵抗的調(diào)控受到營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響，部分解釋了CD36在胰島素抵抗中扮演矛盾作用的潛在原因。

肌肉是機(jī)體主要的胰島素敏感組織，對(duì)調(diào)控葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，密切參與胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制。在高脂飲食狀態(tài)下，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD36基因缺失可以增強(qiáng)小鼠肌肉組織的胰島素敏感性，促進(jìn)葡萄糖的利用。然而，在正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失對(duì)小鼠肌肉胰島素敏感性的影響卻沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。在本研究中，我們主要探討正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失調(diào)控小鼠肌肉胰島素信號(hào)通路的作用機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，CD36基因缺失會(huì)導(dǎo)致正常飲食喂養(yǎng)下小鼠的肌肉組織胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)受損。肌肉組織中蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）表達(dá)在CD36基因缺失小鼠中異常升高，而PTP1B是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子。本研究首次揭示了在正常飲食狀態(tài)下，小鼠CD36基因缺失通過(guò)促進(jìn)肌肉組織中PTP1B的表達(dá)從而導(dǎo)致胰島素敏感性受損的分子機(jī)制。我們的研究部分解釋了CD36基因缺陷患者葡萄糖攝取降低和易發(fā)胰島素抵抗的原因。這一發(fā)現(xiàn)提示可將PTP1B作為預(yù)防和治療CD36基因缺陷人群胰島素抵抗的新靶點(diǎn)。

有關(guān)資料顯示，我國(guó)公眾急救知識(shí)普及率不超過(guò)1%，其中，大學(xué)生接受急救培訓(xùn)的大多數(shù)為醫(yī)學(xué)類的學(xué)生。歐美、日韓等國(guó)家大力推行應(yīng)急救護(hù)培訓(xùn)，其中，美國(guó)公眾基本急救技術(shù)普及率達(dá)89.95%，新加坡衛(wèi)生救護(hù)知識(shí)培訓(xùn)普及率達(dá)20%。我國(guó)開(kāi)展公眾急救知識(shí)培訓(xùn)起步較晚，存在著實(shí)施及資金雙重困難。在我國(guó)人口基數(shù)大、幅員遼闊的國(guó)情下，在不同區(qū)域和不同居民群體中進(jìn)行急救知識(shí)的普及，也存在著許多不同的特性，我國(guó)居民急救能力的培養(yǎng)仍然面臨著較大的挑戰(zhàn)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

野生型（wild type,WT）小鼠為C57BL/6J小鼠，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SYXK(渝)2012-0001。全身性CD36 敲除（CD36）小鼠由美國(guó)Maria Febbraio教授惠贈(zèng)（Lerner Research Institute,U.S.）。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（2014056）。

1.2 主要試劑

飼料（D12450B）；TRIzol RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）；細(xì)胞總蛋白提取試劑（凱基公司）；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒（北京鼎國(guó)公司）；AKT、p-AKT、IRβ、IRS1、IRS2、PI3K抗體購(gòu)自CST；PTP1B 抗體（Proteintech Group）；抗βactin抗體（北京博奧森公司）；免疫共沉淀（Co-IP）試劑（LSKMAGG02）、PVDF膜（Millipore）；免疫熒光二抗（中杉金橋公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Bio-Rad）；引物由擎科引物公司合成；血糖檢測(cè)儀（羅氏）；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)公司）；胰島素（諾和諾德）；胰島素試劑盒（北京鼎國(guó)公司）；claramine（Sigma-Aldrich）。

1.3 動(dòng)物選擇與分組

正常飲食喂養(yǎng)結(jié)束后，所有小鼠禁食過(guò)夜，每組各選6只腹腔注射1 units/kg的胰島素，10 min后收集骨骼肌，-80 ℃保存?zhèn)溆?。用總蛋白提取試劑盒提取肌肉總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，37 ℃條件下3%BSA封閉1.5 h，4 ℃條件下孵育一抗(抗AKT、p-AKT、IR、IRS1、IRS2、PTP1B和β-actin抗體)過(guò)夜，TBST洗3次，每次15min，HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次15 min，利用化學(xué)發(fā)光劑ECL 顯影，條帶的強(qiáng)度用ImageJ軟件（灰度×面積）進(jìn)行定量分析。

1.4 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（GTT）和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（ITT）

檢測(cè)該過(guò)程是根據(jù)制造商的說(shuō)明用Magna ChIP G試劑盒（Millipore）進(jìn)行的。PTP1B啟動(dòng)子特異性引物（表1）。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

根據(jù)基因型將小鼠分為WT組和CD36組，每組12只，正常飲食喂養(yǎng)14周。

1.6 免疫熒光染色

我國(guó)《律師法》修訂多次，始終保留著“公務(wù)員不得兼任執(zhí)業(yè)律師”的規(guī)定。現(xiàn)行的公職律師制度與《律師法》規(guī)定存在沖突，公職律師缺少合法的身份依據(jù)。建議應(yīng)當(dāng)盡快修改《律師法》，盡早實(shí)現(xiàn)“形成社會(huì)律師、公職律師、公司律師、軍隊(duì)律師并存發(fā)展、相互配合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的格局”，把公職律師納入我國(guó)律師制度的整體框架中，為其提供合法的身份依據(jù)，在法律上確認(rèn)其角色定位，明確相關(guān)權(quán)利義務(wù)。

1.7 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

Western blot 檢測(cè)正常飲食喂養(yǎng)條件下WT 和CD36小鼠肌肉中胰島素刺激的蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平，結(jié)果顯示P-AKT/AKT蛋白表達(dá)比值顯著降低（＜0.01，圖2A、B）。CD36小鼠肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）表達(dá)降低，肌肉組織的葡萄糖利用能力減弱（圖2C）。胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中AKT 上游的mRNA和蛋白表達(dá)情況顯示CD36小鼠肌肉中胰島素受體（IR）和胰島素受體底物1/2（IRS1/2）的mRNA水平?jīng)]有降低（圖2D），并且兩組小鼠肌肉中IR、IRS1、IRS2和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的蛋白水平均沒(méi)有顯著差異（＞0.05，圖2E、F）。

1.8 免疫共沉淀

將等量的小鼠肌肉蛋白裂解物與抗體在4 ℃條件下孵育過(guò)夜，然后添加G蛋白磁珠（LSKMAGG02）孵育2 h，冷裂解緩沖液洗滌3次后，將結(jié)合的蛋白質(zhì)在SDS樣品緩沖液中煮沸5 min以洗脫，SDS-PAGE電泳分離上清液蛋白，并用抗IR和IRS1酪氨酸磷酸化的抗體免疫印跡。

1.9 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

正常飲食喂養(yǎng)14周時(shí)，所有小鼠禁食12 h，取尾靜脈血，用血糖檢測(cè)儀測(cè)定此時(shí)血糖濃度，計(jì)為0 min的血糖濃度。然后腹腔注射1 g/kg的D-葡萄糖，分別在30、60、90、120 min后測(cè)定所有小鼠的血糖濃度，即為GTT實(shí)驗(yàn)。ITT實(shí)驗(yàn)則將小鼠禁食4 h，腹腔注射1 units/kg的胰島素，同樣取尾靜脈血，用血糖儀測(cè)定0、30、60、90、120 min的血糖濃度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用-test對(duì)兩樣本進(jìn)行比較，以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

斑潛蠅主要危害西葫蘆葉片，在葉片內(nèi)幼蟲蛀食造成彎曲的隧道，破壞葉綠素和葉肉細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)葉片枯死甚至成片植株死亡。

2 結(jié)果

2.1 CD36基因缺失引起小鼠胰島素敏感性受損

免疫共沉淀（Co-IP）檢測(cè)小鼠肌肉組織中胰島素反應(yīng)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化水平。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，CD36小鼠肌肉中總蛋白的酪氨酸磷酸化水平明顯降低（＜0.05，圖3A、D）。CD36小鼠肌肉中IR的酪氨酸磷酸化水平顯著降低（＜0.01，圖3B、E），同時(shí)發(fā)現(xiàn)IRS1的酪氨酸磷酸化水平也降低（＜0.05，圖3C、F）。

云南省曲靖市麒麟?yún)^(qū)某水庫(kù)位于南盤江右岸一級(jí)支流白石江上，控制流域面積18.3km2，水庫(kù)總庫(kù)容401萬(wàn)m3，興利庫(kù)容357萬(wàn)m3，是一座以灌溉、防洪為主，兼有城市供水等綜合效益的小（1）型水庫(kù)。工程等別為Ⅳ等，主要水工建筑物級(jí)別為4級(jí)，次要建筑物級(jí)別為5級(jí)。除險(xiǎn)加固防洪設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為：擋泄水建筑物按30年一遇洪水設(shè)計(jì)，300年一遇洪水校核。正常水位1941.23m，死水位1921.73m，設(shè)計(jì)洪水位1 941.77 m，校核洪水位1 942.57 m，汛限水位1 939.23 m。

按照免疫熒光試劑盒說(shuō)明書，小鼠肌肉組織切片用山羊血清封閉15 min，抗GLUT4 抗體4 ℃條件下孵育過(guò)夜（放在濕盒中），室溫下避光加入山羊抗兔IgG-FITC孵育30 min，DAPI染液作用10 min，PBS沖洗，黑暗條件下防熒光淬滅劑封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

2.2 小鼠CD36基因缺失降低肌肉組織胰島素敏感性

TRIzol試劑提取肌肉總RNA，并檢測(cè)其含量和純度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在37 ℃5 min、85 ℃5 s、4 ℃5 min條件下1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并保存于-20 ℃。取2 μL cDNA進(jìn)行RT-PCR，β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)總體積為25 μL，設(shè)置擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，共39個(gè)循環(huán)。記錄每個(gè)標(biāo)本和內(nèi)參的Ct值，根據(jù)2計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

2.3 小鼠CD36 基因缺失抑制肌肉IR/IRS1 酪氨酸磷酸化

正常飲食喂養(yǎng)14 周后，注射1 U/kg 的胰島素或1 g/kg的葡萄糖，檢測(cè)所有小鼠0、30、60、90、120 min的血糖水平，并分析胰島素敏感性的差異或糖耐量差異。與WT小鼠相比，CD36小鼠對(duì)胰島素的敏感性明顯減弱（圖1A），胰島素耐量曲線下面積顯著升高（＜0.05，圖1B）。CD36小鼠糖耐量明顯升高(圖1C)，糖耐量曲線下面積顯著降低（＜0.01，圖1D）。CD36小鼠血清胰島素濃度升高（＜0.01，圖1E），胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）也升高（＜0.05，圖1F）。

2.4 CD36基因缺失通過(guò)促進(jìn)肌肉中PTP1B的表達(dá)降低小鼠的胰島素敏感性

CD36小鼠肌肉中PTP1B mRNA 水平明顯升高（＜0.01，圖4A），并且PTP1B的蛋白表達(dá)水平也顯著高于WT 小鼠（＜0.05，圖4D、E）。與WT 小鼠相比，CD36小鼠肌肉中乙酰組蛋白3（H3）與PTP1B啟動(dòng)子的結(jié)合水平增加（＜0.01，圖4B、C）。而claramine 對(duì)PTP1B的藥理抑制有效地消除了CD36小鼠的胰島素敏感性受損（圖4F、G）。

3 討論

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CD36和胰島素抵抗的病因有關(guān)，但其潛在的機(jī)制仍然不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道在肥胖相關(guān)的2型糖尿病患者中CD36過(guò)表達(dá)減弱胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，產(chǎn)生胰島素抵抗。因此通常認(rèn)為CD36缺乏可以改善高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗。但近期有研究顯示，人類CD36基因缺陷患者表現(xiàn)為胰島素抵抗和高脂血癥，并出現(xiàn)代謝綜合征癥狀。自發(fā)性高血壓大鼠缺乏CD36表現(xiàn)為胰島素抵抗和高游離脂肪酸（FFA）水平的代謝表型，轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)CD36可改善這一表型。我們推測(cè)CD36在胰島素抵抗中矛盾的作用可能是由營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)不同所導(dǎo)致的。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在高脂飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失可以增強(qiáng)小鼠肌肉的胰島素敏感性。而本研究結(jié)果表明，在正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失導(dǎo)致小鼠肌肉胰島素敏感性受損，提示CD36基因缺失對(duì)肌肉胰島素敏感性的影響依賴于營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)控。因此將CD36作為治療臨床多種代謝性疾病的靶點(diǎn)時(shí)必須要考慮不同營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)療效的影響。

手機(jī)是抵御聒噪的神器，根據(jù)聒噪的級(jí)別調(diào)節(jié)不同的節(jié)目。比如對(duì)方的語(yǔ)音語(yǔ)調(diào)和風(fēng)細(xì)雨，不影響我刷屏看文字，就首選微信微博；如果對(duì)方語(yǔ)音高亢語(yǔ)調(diào)激昂，逼你入腦入心，分心的方式就只能是看淘寶；如果對(duì)方的言辭激烈，好像你欠他2000元錢似的，這就是在逼我出手了，只好在購(gòu)物車?yán)飫澙?，?duì)自己好一點(diǎn)吧，該買的就買，否則咋辦？人家已經(jīng)對(duì)咱這么不客氣，咱自己總得對(duì)自己客氣些吧？

經(jīng)典的胰島素信號(hào)包括IR、IRS1、IRS2、PI3K 和AKT等，它們?cè)谝葝u素在許多類型的細(xì)胞和組織的代謝活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。IR屬于酪氨酸激酶家族，由α亞基和β亞基組成，胰島素發(fā)揮生物學(xué)作用首先與細(xì)胞膜上的IRα結(jié)合，使IRβ自身磷酸化，隨后通過(guò)IRS1、IRS2、PI3K和AKT等信號(hào)通路發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)。其中AKT的磷酸化激活是反應(yīng)胰島素敏感性的金指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)在正常飲食條件下，CD36小鼠肌肉中p-AKT/AKT的蛋白比值和GLUT4的表達(dá)顯著降低，提示CD36基因缺失降低肌肉組織的胰島素敏感性，且葡萄糖利用能力減弱。接著檢測(cè)胰島素信號(hào)通路中AKT 上游的mRNA 和蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CD36小鼠肌肉中IR、IRS1、IRS2和PI3K的mRNA和蛋白水平均沒(méi)有顯著差異，提示CD36小鼠不是通過(guò)降低肌肉中IR/IRS1/IRS2/PI3K信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平導(dǎo)致胰島素敏感性受損。胰島素信號(hào)通路是由IR引發(fā)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化級(jí)聯(lián)激活的，因此我們分析了小鼠肌肉中胰島素反應(yīng)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化水平。結(jié)果顯示，CD36小鼠肌肉中胰島素刺激的IR和IRS1的酪氨酸磷酸化水平明顯降低，表明CD36基因缺失可以通過(guò)降低肌肉中IR/IRS1的酪氨酸磷酸化水平抑制胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)。而胰島素信號(hào)通路的缺陷是胰島素抵抗的主要原因。以上結(jié)果提示在正常飲食條件下，CD36基因缺失可以通過(guò)抑制IR/IRS1的酪氨酸磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致肌肉組織胰島素敏感性受損。

胰島素在發(fā)揮作用過(guò)程中最重要的是與胰島素受體結(jié)合，使胰島素受體磷酸化從而激活下游信號(hào)通路，而PTP1B能夠使磷酸化的胰島素受體去磷酸化，從而阻斷下游信號(hào)通路的激活。因此，PTP1B作為胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的重要負(fù)調(diào)控因子，在胰島素抵抗中發(fā)揮著重要作用。目前PTP1B已成為治療2型糖尿病的新靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)PTP1B是全身胰島素敏感性的主要調(diào)節(jié)因子。PTP1B小鼠在肝臟和肌肉兩大主要代謝靶組織中表現(xiàn)出增強(qiáng)的IR和IRS1酪氨酸磷酸化。我們首次揭示了CD36在調(diào)節(jié)小鼠肌肉組織中PTP1B表達(dá)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在正常飲食條件下，CD36小鼠肌肉中PTP1B表達(dá)增加，且PTP1B基因啟動(dòng)子的組蛋白乙?；揭诧@著升高。本課題組前期研究顯示CD36 可以通過(guò)ROS 影響肝細(xì)胞組蛋白去乙酰化酶HDAC表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控靶基因啟動(dòng)子組蛋白乙?；剑崾綜D36可以影響基因的表觀修飾，CD36小鼠肌肉PTP1B 啟動(dòng)子乙酰化水平升高可能與ROS/HDAC途徑相關(guān)，但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步解析。此外PTP1B抑制劑阻斷了CD36基因缺失對(duì)小鼠胰島素敏感性受損的影響。以上結(jié)果表明，PTP1B在CD36小鼠肌肉的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用，提示CD36基因缺失可以通過(guò)促進(jìn)PTP1B的表達(dá)從而抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)引起肌肉組織的胰島素敏感性受損。

綜上所述，在正常飲食狀況下，CD36基因缺失通過(guò)削弱IR/IRS1通路的酪氨酸磷酸化導(dǎo)致肌肉組織的胰島素敏感性受損，其機(jī)制可能與PTP1B基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。該研究表明CD36基因?qū)τ诰S持肌肉生理的胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)至關(guān)重要，CD36基因以非脂質(zhì)依賴的分子機(jī)制調(diào)控生理胰島素信號(hào)通路。我們的研究結(jié)果為闡明臨床上CD36基因缺陷患者葡萄糖攝取降低和易發(fā)胰島素抵抗這一現(xiàn)象提供了理論依據(jù)。