尚 蕾，丁光樹，莫曉婷，孫 敬，孫 輝，白 雪，袁麗萍，李萬水

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

快速突變Y-STR基因座（rapidly-mutating Y-STRs,RM Y-STRs）自2010年報道以來[1]，獲得了國內(nèi)外的廣泛關注。因其突變率較高，可在常見Y-STR基因座的基礎上進一步區(qū)分不同的男性個體，尤其是男性近親屬，在男性家系排查等方面具有重要的應用價值[2]。目前，已報道的快速突變Y-STR基因座共有13個，包括5個多拷貝基因座和8個單拷貝基因座[1]。大量的研究探討了快速突變Y-STR基因座的突變特征[3-7]，比較了其與Yfiler Plus、PowerPlex Y23等試劑盒的分辨效能[8-10]。同時，一些研究建立了包含快速突變基因座的復合擴增體系。然而，這些研究所建立的體系仍存在如下不足：1）包含的快速突變基因座數(shù)量相對較少[11]；2）分為2～3個體系進行擴增，而非在同一體系中擴增全部13個基因座，擴增效率低[2,12]；3）針對DYF403S1基因座的引物設計不完全合理，可能導致后期分型判斷困難[13-14]；4）針對DYS526基因座，只擴增DYS526b而忽略了DYS526a，人為降低了該基因座的基因多樣性水平[15-16]。此外，各研究針對具有復雜核心序列的快速突變Y-STR基因座命名方式并不統(tǒng)一。

因此，本文擬建立一個更全面合理的五色熒光復合擴增體系，以實現(xiàn)全部13個快速突變Y-STR基因座的有效擴增。同時，探討并推薦13個快速突變Y-STR基因座的命名方式，針對新構建體系開展性能驗證，為其法醫(yī)學應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本

人類基因組標準品（9948、2800M、9947A），其他生物樣本（恒河猴、食蟹猴、馬、牛、羊、貓、鼠、兔、雞、鴨）由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供并通過其實驗動物使用與管理委員會的倫理審查。

1.2 遺傳標記

本研究構建的體系包含國際報道的13個快速突變 Y-STR基 因 座：DYF387S1、DYF399S1、DYF 403S1、DYF404S1、DYS526、DYS449、DYS518、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626、DYS627[1]。其中，前5個為多拷貝基因座，其余8個為單拷貝基因座。

1.3 基因座排布及等位基因的命名

基于五色熒光技術，根據(jù)各基因座核心重復區(qū)的特點，將上述基因座均勻排布于80～460 bp的區(qū)間內(nèi)。利用Primer v.5.0軟件進行基因座的引物設計，各基因座的正向或反向引物分別標記藍色（FAM）、綠色（HEX）、黃色（TAMRA）或紅色（ROX）熒光基團。內(nèi)標則以橙色（LIZ）標記。

國內(nèi)外當前對快速突變Y-STR基因座命名方式尚不統(tǒng)一，通過檢索文獻、基因座擴增測序驗證等方法進行綜合研究，探求較合理的等位基因命名方式。

1.4 PCR擴增與檢測

首先，針對單個基因座進行擴增，以檢驗引物設計的特異性。擴增選用10 μL體系：5 μL 2×Master Mix （公安部物證鑒定中心），各1 μL 上、下游引物（終濃度均為 1 μmol/L），3 μL 1×TE，以及 1 ng 模板DNA。然后，將全部13個基因座復合到一個體系中進行擴增，選用10 μL體系：5 μL 2×Master Mix，5 μL引物混合液，1 ng模板DNA。PCR擴增程序：95 ℃預變性11 min；94 ℃變性30 s, 59 ℃退火2 min,72 ℃延伸1 min，循環(huán)28次；60 ℃延伸1 h。

檢測時，取1 μL PCR擴增產(chǎn)物，加入10 μL去離子甲酰胺和0.15 μL內(nèi)標（Typer500，公安部物證鑒定中心）的混合物中，于3500 XL型遺傳分析儀進行毛細管電泳，對上述Y-STR基因座進行熒光檢測。所得檢測數(shù)據(jù)以Genemapper ID-X v.1.5進行分析，設置50 RFU的檢測閾值。

為驗證個別基因座（DYS612、DYS626、DYS547）的核心重復序列，在進行單基因座擴增后，取擴增產(chǎn)物進行Sanger法測序（生工生物，上海），并利用MEGA v.7.0.26軟件分析測序文件。

1.5 復合擴增體系的優(yōu)化

設置不同的退火溫度（55、57、59、61、63 ℃）、不同的PCR循環(huán)數(shù)（24、26、28、30、32）、不同的體系體積（5、10、20 μL），探討退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)、體系體積變化對擴增效果的影響。擴增模板為1 ng 男性基因組標準品9948。

1.6 等位基因分型標準物的制備

利用熒光標記的單基因座引物擴增各基因座的等位基因重組質(zhì)粒，以一定比例進行混合，獲得本研究體系的等位基因分型標準物。

1.7 體系的性能指標驗證

1.7.1 靈敏度

體系中DNA（男性基因組標準品9948）模板量分別設置為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 ng，研究體系獲得完整分型的最小模板量。

1.7.2 種屬特異性

檢測哺乳類動物（恒河猴、食蟹猴、馬、牛、羊、貓、鼠、兔）和非哺乳類動物（雞、鴨）等的DNA 樣品，以確定體系是否具有良好的種屬特異性。

1.7.3 穩(wěn)定性

選擇 EDTA、血紅素（hematin, HE）、腐殖酸（humic acid, HA）、靛藍等常見的抑制劑進行體系穩(wěn)定性的檢驗。其中，EDTA的濃度梯度設置為：0. 25、0.5、0.75、1.0 mmol/L；血紅素的濃度梯度設置為1.5、1.75、2.0、2.25 mmol/L；腐殖酸的濃度梯度設置為50、100、150、200 ng/μL；靛藍的濃度梯度設置為 2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L。各濃度梯度設置3～4 次重復。擴增模板為1 ng男性基因組標準品9948。

1.7.4 混合樣本

取不同的男性DNA標準品（9948、2800M）分別以1∶19、1∶9、1∶3、1∶1、3∶1、9∶1、19∶1 的濃度比例混合，取混合物1 ng加入體系中擴增并進行分型檢測，每個比例設置3 次重復。取男性DNA標準品（9948）和女性標準品（9947A）分別以1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000的比例混合加入體系中進行擴增檢測，體系中9947A的加入量為500 ng，9948的加入量分別為0.5、0.25、0.125 ng，設置3次重復。

2 結果

2.1 基因座排布與等位基因命名

快速突變Y-STR復合擴增體系（RM Y-STR體系）的基因座排布如圖1所示?；蜃鵇YS526由于兩個拷貝的擴增產(chǎn)物大小不同，占據(jù)了panel中的兩個不同位置。基因座DYF403S1占據(jù)了panel中的三個不同位置，這與其不同拷貝及其核心重復區(qū)結構有關。

經(jīng)Sanger法測序，進一步驗證了DYS612、DYS626等基因座的核心重復序列，同時發(fā)現(xiàn)，DYS547的核心重復序列為(CCTT)nT(CTTC)mN54(TTTC)pN10(CCTT)4(TCTC)1(TTTC)q，與部分文獻報道的不同。結合測序結果和文獻查閱，建議各基因座的等位基因命名方式及相應標準品（9948、2800M）分型結果見表1。

表1 快速突變Y-STR基因座的核心重復序列及推薦命名方式（參考文獻[10], [12], [17]）Table 1 Core repetitive sequences and recommended nomenclature of rapidly-mutating Y-STR loci (citations[10], [12], [17])

2.2 復合擴增體系的優(yōu)化

2.2.1 退火溫度

利用不同退火溫度進行體系擴增，結果顯示，當退火溫度較低（55 ℃）時，容易出現(xiàn)非特異性擴增，產(chǎn)生較多雜帶，而當退火溫度為63 ℃時，則會出現(xiàn)部分等位基因丟失（圖2）。比較其他3個退火溫度的擴增結果可見，當退火溫度為59 ℃時獲得的圖譜擴增的特異性和均衡性最佳。

2.2.2 擴增循環(huán)數(shù)

采用不同擴增循環(huán)數(shù)進行體系擴增，結果顯示，在不同擴增循環(huán)次數(shù)下均未出現(xiàn)等位基因丟失的情況。但隨著PCR擴增循環(huán)次數(shù)增加，檢測得到的熒光峰高逐漸增加（圖3）。循環(huán)數(shù)少（24或26），基因座整體的擴增效率相對較低。循環(huán)數(shù)多（32），短小片段的擴增優(yōu)勢明顯，影響體系擴增的均衡性。

通常情況下，建議采用28次循環(huán)進行擴增，而在樣本質(zhì)量較差時，可增加循環(huán)數(shù)至30次，以獲得更佳的擴增結果。

2.2.3 反應體積

不同反應體積的擴增結果如圖4所示。發(fā)現(xiàn)采用不同的反應體積擴增均未出現(xiàn)等位基因丟失的現(xiàn)象，表明反應體積不會影響基因座擴增的完整性，同時，對擴增后各基因座的均衡性也無明顯影響。

在添加模板量相同的情況下，較小體積的反應體系在擴增后呈現(xiàn)出較高的熒光檢測峰高，反之亦然。實際應用可依據(jù)實際情況選擇擴增反應體系的體積。

2.3 等位基因分型標準物

快速突變Y-STR復合擴增體系的等位基因分型標準物如圖5所示。

由圖可見，各基因座的等位基因無交叉重疊，峰形尖銳，有助于獲得明確、清晰的Y-STR分型結果。同時，各基因座的等位基因均已測序確認。

2.4 體系的有效性驗證

2.4.1 靈敏度

由圖6可見，當模板量≥0.125 ng時，全部基因座的所有等位基因均可實現(xiàn)正常分型，而當模板量＜0.125 ng時，部分等位基因出現(xiàn)丟峰現(xiàn)象，表明快速突變Y-STR擴增體系具有較高的檢測靈敏度。

2.4.2 種屬特異性

對所選哺乳類動物（恒河猴、食蟹猴、馬、牛、羊、貓、鼠、兔）的DNA進行擴增檢驗分析，均未獲得擴增條帶。同時，對人類經(jīng)常接觸的非哺乳類動物（雞、鴨）的DNA進行檢測，也未發(fā)現(xiàn)擴增條帶。表明快速突變Y-STR擴增體系具有較好的種屬特異性。

2.4.3 穩(wěn)定性

當加入終濃度為0.5 mmol/L的EDTA、1.5 mmol/L的血紅素或4 mmol/L的靛藍時，各基因座均未出現(xiàn)丟帶現(xiàn)象。隨著體系中EDTA、血紅素或靛藍的濃度繼續(xù)增加，基因座擴增受到抑制，檢測峰丟失（圖7）。在體系中加入50 ng/μL的腐殖酸，體系會偶發(fā)丟帶現(xiàn)象，隨著腐殖酸濃度的增加，丟帶現(xiàn)象愈加明顯。

2.4.4 混合樣本

在高濃度的女性背景下（男性成分與女性成分之比為1∶1000～1∶4000），所構建的RM Y-STR體系均能獲得完整的Y-STR分型（圖8）。但在DYS627和DYS518基因座之間出現(xiàn)了非特異性擴增峰，并滲透到其他熒光色。

經(jīng)后期實驗驗證，在擴增不同高濃度樣本（包括男性樣本和女性樣本）時可能會在同一位置出現(xiàn)該非特異性峰，對男性樣本分型的判斷影響不大，但在數(shù)據(jù)分析時應加以注意。

針對不同比例的9948/2800M混合樣本，所構建RM Y-STR體系均可以獲得兩者的完整分型，如圖9所示。在實驗設置的混合比例下，混合樣本中次成分DNA的Y-STR分型檢出比例均為100%。

3 討論

3.1 快速突變Y-STR命名方式

目前國內(nèi)外針對快速突變Y-STR基因座的命名方式尚不統(tǒng)一，這可能會影響該類基因座或試劑盒在案件排查等方面的應用。結合已有資料和實驗驗證，本研究整理出了推薦命名方式，該命名方式符合ISFG針對Y-STR基因座提出的命名規(guī)則[18]，同時與Zhang等[17]在2016年提出的命名方式完全相同，但與其他研究報道的命名方式存在差異[10,14,19-21]。尤其DYS547基因座，其核心重復序列存在兩個堿基的差異。本研究獲得的序列與Zhang等[17]獲得的序列一致，為(CCTT)nT(CTTC)mN54(TTTC)pN10(CCTT)4(TCTC)1(TTTC)q，而 UCSC 網(wǎng)站（genome.ucsc.edu）及其他研究報道的序列則為(CCTT)nT(CTTC)mN56(TTTC)pN10(CCTT)4(TCTC)1(TTTC)q。這或許與不同人群的序列差異有關。綜上，建議盡快推出關于此類基因座的等位基因命名標準，統(tǒng)一命名規(guī)則，為后期應用提供重要參照。

3.2 本研究建立體系的特點

與國內(nèi)外已建立的同類體系相比，本研究建立的RM Y-STR體系在多方面有所改進。首先，在一個體系中可以同時擴增全部13個快速突變基因座。其次，針對特殊基因座，可實現(xiàn)多個拷貝的分別擴增。如DYF403S1基因座含有4個拷貝，其中3個拷貝的核心序列結構十分相似，可縮寫為(TTCT)nN2-3(TTCT)p。參照Lee等[12]提出的方法改進引物后，可將含有不同核心序列結構的拷貝分開擴增，從而使分型判定更加準確。再如DYS526基因座，通過引物設計可分別擴增出DYS526a和DYS526b兩個拷貝，能獲得該基因座更多的遺傳信息。再次，體系的全部基因座在4種熒光標記、80～460 bp的區(qū)間內(nèi)均勻排布，更具實用性。

3.3 體系性能比較

經(jīng)測試，本研究構建的體系具有較好的靈敏度、種屬特異性和穩(wěn)定性。靈敏度方面，RM Y-STR體系可達0.125 ng，與Yfiler、Yfiler Plus等試劑盒的靈敏度相當[22-23]，而略低于PowerPlex Y23試劑盒的靈敏度[24]。穩(wěn)定性方面，RM Y-STR體系可耐受1.5 mmol/L血紅素，高于Yfiler、Yfiler Plus、Power-Plex Y23等試劑盒已報道的可耐受濃度[22-24]；該體系基本可耐受50 ng/μL的腐殖酸，比Yfiler Plus和PowerPlex Y23等試劑盒的穩(wěn)定性略差[23-24]，與DNATyperY26的結果相近[25]。究其原因，RM Y-STR體系中包含5個多拷貝基因座，這些基因座在Y染色體上擁有不少于2個拷貝，意味著在擴增時同一對引物需要同時結合在染色體2～4處不同位置上，擴增難度更大。此外，擴增緩沖液也可能對體系的穩(wěn)定性造成影響。

RM Y-STR體系對混合樣本具有較好的擴增效果。在實驗設置的混合比例下，均未出現(xiàn)次成分丟峰的情況。本體系對男性與女性混合樣本的擴增性能可達到或高于Yfiler Plus、PowerPlex Y23、DNATyper Y26等試劑盒[23-25]；對男性混合樣本的擴增性能與Yfiler相當[24]，略高于上述三種試劑盒[23-25]。擴增性能的提升，一方面與使用的擴增緩沖液有關，另一方面，可能受到體系所含基因座拷貝數(shù)的影響。體系中含有的基因座拷貝數(shù)越多，在模板量較低時獲得完整分型的難度越大。

4 結論

RM Y-STR體系與Yfiler Plus試劑盒或DNATyper Y36試劑盒聯(lián)用，可以增加7個基因座（14個基因座拷貝）的檢測結果，與PowerPlex Y23試劑盒聯(lián)用，可以增加11個基因座（19個基因座拷貝）的檢測結果。RM Y-STR復合擴增體系有望成為既有主流Y-STR試劑盒的重要補充，輔助男性家系的精細化排查，為案件偵辦提供更多線索。