李本淳，王婧姝，李巖，商麗麗，趙艷*

1.四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000；2.吉林師范大學(xué)，吉林 四平 136000；3.白城市食品藥品檢驗所，吉林 白城 137000

甘草炭為豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根和根莖的炮制加工品[1]，為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第5 冊收載的女寶膠囊的成分之一[2]?！秱s病論》的260 個方劑中共有125 方涉及甘草[3]，而在《傷寒論》中應(yīng)用炙甘草者多達68 首[4]。所用炙甘草并非蜜炙甘草而是炒甘草，其本質(zhì)是將甘草部分炭化[5?6]，且已經(jīng)在荊芥炭、麥芽炭、枳實炭、蒲黃炭等炒炭的中藥中發(fā)現(xiàn)了納米類成分。這些納米類成分具有較好的止血、降糖、鎮(zhèn)痛、保肝、抗炎等功效。在甘草炭中也發(fā)現(xiàn)了納米類成分，通過小鼠急性酒精性胃潰瘍模型證明納米類成分具有抗?jié)冏饔肹7]。

目前，國家藥品標準及各省市地方標準尚未收載甘草炭的炮制工藝及質(zhì)量標準，藥品生產(chǎn)企業(yè)使用的甘草炭均為廠家自行炮制，沒有統(tǒng)一的炮制規(guī)范來控制其質(zhì)量。本研究在傳統(tǒng)炮制法的基礎(chǔ)上，篩選出具有代表性、可行性的炮制方法，通過L9（34）正交試驗進一步優(yōu)化炮制工藝，參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（四部）相關(guān)方法，建立了甘草炭的炮制工藝及質(zhì)量標準，為甘草炭飲片的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ?300型超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；BT125D型電子天平（德國賽多利斯公司）；MS?5型炒藥機（常州邁斯機械有限公司）；CYJ900 型炒藥機（山東創(chuàng)美機械科技有限公司）；迷你型紅外測溫儀（深圳華盛昌機械實業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

對照品甘草苷（批號：111610?201607，純度：93.1%）、甘草酸銨（批號：110731?201720，純度：97.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純；水為自制超純水。

甘草飲片為吉林省北藥藥材加工有限公司提供，批號為20180501，經(jīng)四平市食品藥品檢驗所副主任藥師梁帥檢定為正品，按照《中國藥典》2020 年版（一部）甘草（甘草片）項下檢驗，各項均符合規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制工藝研究

2.1.1 影響因素及水平的選擇 通過查閱文獻［8?11］及參考前期的研究工作，確定甘草炭的炒炭溫度（紅外測溫儀測得炒藥機內(nèi)壁溫度，A）、炒炭時間（B）和翻炒頻率（C）作為考察因素。以甘草炭的水溶性浸出物、有效成分甘草苷和甘草酸的含量作為評價指標。采用L9（34）正交設(shè)計對甘草炭的炮制工藝進行優(yōu)選，通過加權(quán)法進行評分，對試驗結(jié)果進行分析。最后結(jié)合正交試驗結(jié)果和炮制過程的評價篩選出既能滿足甘草炭炮制目的，也符合現(xiàn)代藥學(xué)理論的炮制工藝。

2.1.2 正交試驗因素、水平的設(shè)計 根據(jù)前期的實驗結(jié)果，甘草片質(zhì)堅實、切面有一定的纖維性、部分有裂隙，炒炭溫度在300 ℃以下長時間炒炭內(nèi)部會先于外部炭化，需要提高溫度短時間內(nèi)迅速炒炭。選取大小均勻甘草片9 份，每份4 kg，置于炒藥機內(nèi)，按正交設(shè)計方案進行試驗，得到各甘草炭炮制品，并采用綜合評分法進行加權(quán)評分。炒炭要求存性，性狀為判斷炒炭樣品是否符合要求的先決條件，在此基礎(chǔ)上再進一步通過水溶性浸出物與指標性成分（甘草苷和甘草酸）的含量測定結(jié)果來細化炒炭條件。規(guī)定性狀、浸出物和含量測定的權(quán)重系數(shù)分別為0.50、0.25、0.25，按公式（1）計算綜合評分（Y）。

式中，Y1為性狀賦分結(jié)果，Y2為浸出物結(jié)果，Y3為含量測定結(jié)果，Ymax為結(jié)果中最大值。

依據(jù)評分標準對不同條件下制備的炮制品進行打分，甘草炭性狀按照外表面焦黑褐色、斷面焦褐色為標準進行打分，浸出物和含量測定按照結(jié)果數(shù)值即分值進行打分，見表1～3。

表1 甘草炭炮制正交設(shè)計因素水平

表2 甘草炭L9(34)正交試驗因素水平分析

表3 甘草炭炮制結(jié)果方差分析

根據(jù)正交試驗分析表和方差分析表可以得到，A 對實驗結(jié)果的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,而B、C對實驗結(jié)果影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。翻動頻率選擇更快的C3，保證炒炭的樣品的均勻性。綜合評分結(jié)果，確定最佳工藝為A2B1C3，即溫度為360 ℃，炒炭6 min，翻動頻率25 r·min-1。

2.1.3 最佳炮制工藝條件的驗證實驗 選取甘草片4 kg，平行稱取5份，按最佳炮制工藝制備甘草炭樣品，計算浸出物和含量測定的值。結(jié)果見表4。

表4 最佳炮制工藝條件甘草炭驗證實驗結(jié)果 %

2.2 甘草炭質(zhì)量標準

2.2.1 性狀 本品呈類圓形或橢圓形的厚片，直徑為0.6～3.5 cm，表面焦黑褐色，折斷面呈焦褐色，略具焦香氣，味微苦。

2.2.2 顯微鑒別 粉末深棕色，纖維成束，直徑為8～14 μm，壁厚，微木化，周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。草酸鈣方晶多見，具緣紋孔導(dǎo)管較大。

2.2.3 薄層色譜 由于甘草炮制后成分含量發(fā)生變化，《中國藥典》2020 年版（一部）甘草項下薄層色譜方法鑒別甘草及甘草酸單銨鹽的斑點不明顯，背景干擾較大，改為對甘草次酸指標的鑒別。取甘草炭粉末2 g，加鹽酸2 mL、三氯甲烷15 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取甘草次酸對照品，加乙醇制成含甘草次酸對照品2 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述3種溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）?甲苯?乙酸乙酯?冰乙酸（10.0∶20.0∶7.0∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點（圖1）。

圖1 甘草炭薄層色譜圖

2.2.4 檢查總灰分 取10 批甘草炭供試品，照《中國藥典》2020 年版（四部）通則2302 方法進行測定。10 批甘草炭的總灰分均在5.2%以下，較甘草片提高了約0.7%，故規(guī)定本品的總灰分不得超過6.0%（表5）。

2.2.5 浸出物 女寶膠囊中甘草炭為水提工藝，選擇水作為提取溶劑，取10 批甘草炭供試品，照水溶性浸出物測定法［《中國藥典》2020 年版（四部）通則2201］項下的熱浸法測定，用水作溶劑進行試驗。10 批甘草炭水溶性浸出物最高值為20.5%，最低值為17.1%，平均值為18.5%，擬定干品浸出物限度為不得少于14.0%（表5）。

表5 甘草炭總灰分、浸出物測定結(jié)果 %

2.2.6 甘草苷和甘草酸含量測定

2.2.6.1 色譜條件 甘草炒炭后成分發(fā)生變化，調(diào)整梯度洗脫的溶劑比例以便分離。色譜柱：Sepax BR?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，0.05%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～50 min，19%～42%A；50～55 min，42%～100%A；55～60 min，100%～19%A）；流速：1.0 mL·min-1；波長：237 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 對照品和甘草炭HPLC圖

2.2.6.2 供試品溶液的制備 經(jīng)考察，炮制后的甘草苷和甘草酸的含量明顯降低，為使含量結(jié)果在合理的線性范圍內(nèi)，增加甘草炭的取樣量，取甘草炭粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.6.3 對照品溶液的制備 稱取甘草苷對照品11.80 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，稱取甘草酸銨對照品（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7）20.82 mg，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.6.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取甘草苷對照品溶液0.2、0.4、0.6、1.0、1.5、2.0 mL置50 mL量瓶中，分別精密量取甘草酸銨對照品儲備液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mL 置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述不同質(zhì)量濃度對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。以對照品峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，計算回歸方程，甘草苷：Y=15.357X+2.231 7（r=0.999 8），在4.39～43.94 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好；甘草酸銨：Y=5 784.7X-1.802 8（r=1.000 0），在25.43～610.20 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.6.5 精密度試驗 取甘草炭（批號：20180501）供試品溶液，按2.2.6.1 項下方法連續(xù)進樣6 次，測得甘草苷和甘草酸峰面積的RSD 分別為0.3%和0.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6.6 重復(fù)性試驗 稱取甘草炭（批號：20180501）供試品約2 g，精密稱定，平行6 份，按2.2.6.2 項下方法制備，按2.2.6.1 項下方法測定，測得甘草苷和甘草酸含量的RSD 分別為1.0%和0.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6.7 穩(wěn)定性試驗 取甘草炭（批號：20180501）供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、18、24 h 按2.2.6.1 項下方法測定，考察供試品溶液穩(wěn)定性，測得甘草苷和甘草酸含量的RSD 分別為1.0%和0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6.8 加樣回收率試驗 分別精密稱定甘草苷對照品和甘草酸銨對照品16.05、40.94 mg，置1000 mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為甘草苷和甘草酸銨混合對照品儲備液。稱取甘草炭（批號：20180501）供試品（甘草苷質(zhì)量分數(shù)為0.076%，甘草酸質(zhì)量分數(shù)為0.206%）約2 g，精密稱定，平行6 份，分別精密加入甘草苷和甘草酸銨混合對照品儲備液100 mL，按照供試品溶液的制備方法制備，計算加樣回收率，結(jié)果見表6，表明本方法回收率良好。

表6 甘草苷和甘草酸加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.6.9 甘草苷和甘草酸含量 稱取10 批甘草炭供試品，每批2 g，精密稱定，按2.2.6.2 項下方法制備，按2.2.6.1 項下方法測定，計算甘草炭中甘草苷和甘草酸的含量，分析炮制前后的變化[12?14]。結(jié)果見表7。

表7 甘草苷、甘草酸含量測定結(jié)果 %

10批甘草炭中甘草苷和甘草酸含量較炮制前明顯降低，由甘草炭和甘草片的含量比值可知，甘草苷為炒炭前的9.8%，甘草酸為炒炭前的9.3%。根據(jù)《中國藥典》2020年版（一部）甘草片中含甘草苷不得少于0.45%、甘草酸不得少于1.8%的限值，擬定甘草炭中甘草苷不得少于0.044%，甘草酸不得少于0.16%。

3 討論

現(xiàn)代飲片加工生產(chǎn)對炮制工藝的各項指標提出了量化的要求，一些生產(chǎn)企業(yè)使用150～220 ℃的武火炒制的甘草炭無法達到炒炭的要求，傳統(tǒng)中藥炮制未對武火溫度明確要求，應(yīng)根據(jù)具體的品種調(diào)整火力，使飲片符合要求，達到炒炭存性的目的。

甘草炒炭后原有的成分及含量均發(fā)生較大變化，甘草苷和甘草酸的含量明顯降低，在滿足性狀要求的同時，選擇合理的含量作為甘草炭的評測指標，控制甘草炭飲片的質(zhì)量。