許春麗，曹立冬，李遠播，黃啟良

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193）

水凝膠是具有三維網絡結構的聚合物結構體系，由含有親水基團的大分子通過共價鍵、氫鍵、范德華力等作用力形成。水凝膠具有保水性好、敏感釋放、合成工藝簡單等優(yōu)點，被廣泛用于農業(yè)領域來改善植物的水分可用性[1-3]，以及通過負載農藥活性成分以達到緩釋、降低農藥殘留等效果[4]。水凝膠的基底材料具有多樣性，其中具有生物相容性、生物可降解性等特點的多糖類天然高分子羧甲基殼聚糖（CMCS）受到了人們的廣泛關注[5-7]。羧甲基殼聚糖具有良好的抑菌性能，與金屬離子螯合后形成的復合體系也表現(xiàn)出良好的抑菌效果。研究報道O-羧甲基殼聚糖銅配合物對辣椒疫霉菌、玉米赤霉病和蘋果炭疽病的抑菌效果好于殼聚糖的抑菌效果[8]；木質素和銅復合物對番茄立枯病病原菌的抑菌效果好于商品化的氫氧化銅抑菌效果[9]。

丙硫菌唑是由拜耳公司研發(fā)生產的一種新型三唑硫酮類殺菌劑，主要用于由子囊菌、擔子菌以及半知菌引起的病害。作用模式為通過抑制目標菌中甾醇14α-去甲基化酶來干擾麥角甾醇的合成[10]。丙硫菌唑于2019年在我國登記，但已經登記的劑型十分有限。目前對丙硫菌唑緩釋制劑的研究較少[11-12]，考慮到水凝膠農藥緩釋制劑的良好性能和應用前景，我們前期以CMCS為基底材料與Mn2＋螯合形成水凝膠，采用擠出-外源凝膠法制備了丙硫菌唑水凝膠微球，并通過正交試驗進行了制備條件的優(yōu)化[13]。研究結果表明，所制備的丙硫菌唑水凝膠微球具有良好的pH敏感溶脹和釋放性能，與丙硫菌唑原藥相比，前者可以增強對小麥全蝕病的殺菌能力，且對小麥的生長具有營養(yǎng)功能[13]。然而，將CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球施用于小麥種子后，有關丙硫菌唑及其代謝產物脫硫丙硫菌唑在土壤、小麥根部和地上部中不同生長周期內的劑量分布尚未見報道。因此，深入研究其劑量傳輸及分布行為有助于加深對提升丙硫菌唑水凝膠微球性能的理解并拓展其應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

供試作物：小麥‘農大211’。

供試藥劑：丙硫菌唑原藥（純度99%），四川華英化工有限公司；羧甲基殼聚糖（羧化度86.2%，分子量≥10萬g/mol），北京華威銳科化工有限公司；MnSO4·H2O、吐溫80（Tween-80）和無水硫酸鎂均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純），美國賽默飛世爾科技有限公司；乙腈（色譜純），德國默克集團有限公司；試驗用水為超純水。

供試儀器：DF-101Z型恒溫加熱電磁攪拌器，上海司樂儀器有限公司；TG20-WS離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀、超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS），美國賽默飛世爾科技有限公司；火焰原子吸收分光光度計，德國耶拿分析儀器股份有限公司。

1.2 高效液相色譜分析

流動相為甲醇-0.1%甲酸水（80∶20，V/V），流速為1.0 mL/min；Agilent TC-C18不銹鋼色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；檢測波長為260 nm；進樣量為5μL；柱溫為25℃；進樣體積為5μL；流速為1 mL/min。

1.3 CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球的制備

本試驗采用乳化交聯(lián)的方法制備CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球。CMCS的官能團可以通過配位鍵螯合金屬離子形成具有不同大小和形態(tài)的復合物。CMCS和金屬離子之間的絡合可用于制備一系列超分子水凝膠。CMCS具有親水性，而丙硫菌唑是疏水性農藥，故采用乳化法將丙硫菌唑分散在CMCS溶液中，然后將乳液用注射器逐滴注入金屬離子水溶液。溶液中CMCS和Mn2＋接觸后立即發(fā)生離子交聯(lián)反應，隨后通過CMCS和金屬離子間的配位和離子交換形成水凝膠。具體方法如下：先將丙硫菌唑溶于二氯甲烷中，加入乳化劑混合均勻作為油相，將一定質量濃度的CMCS水溶液作為水相；將二者混合，在設定的剪切速率（10 000 r/min）下高速剪切5 min，形成O/W乳液；將乳液置于帶有6#針頭（內徑為0.6 mm）的注射器中，逐滴滴加到Mn2＋溶液，反應4 h后固化成微球顆粒；用紗布過濾凝膠顆粒，同時用大量去離子水洗滌凝膠表面未參與反應的Mn2＋，于60℃烘箱中干燥，過夜后收集載藥凝膠微球顆粒。

1.4 CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球載藥率、包封率的測定

參照王召等[14]方法進行凝膠微球的處理：稱取10 mg載藥樣品，加入5 mL解離液，待溶解完全后，加入至10 mL容量瓶中并用甲醇定容，過0.22μm有機濾膜，通過高效液相色譜檢測丙硫菌唑的含量。按式（1）、（2）分別計算載藥樣品的載藥率和包封率。

1.5 凝膠顆粒中Mn2＋裝載量測定

采用火焰原子吸收分光光度計對凝膠微球顆粒中的Mn2＋含量進行研究，檢測波長為279 nm。用干凝膠顆粒中Mn2＋的質量分數(shù)表示其裝載量，按式（3）計算。

式中：CMn為樣品中Mn2＋的質量濃度，mg/L；V為樣品的體積，L；Wd為凝膠顆粒的質量，mg。

1.6 單因素試驗設計

單因素試驗設計參數(shù)如表1所示。以乳液中CMCS質量分數(shù)為4%，乳化劑Tween-80質量分數(shù)為2%；油水比為1∶10（V/V）；交聯(lián)劑濃度為0.2 mol/L作為基礎條件。試驗均重復3次。

表1 單因素試驗設計參數(shù)

1.7 CMCS-丙硫菌唑水凝膠微粒在小麥植株中的劑量分布規(guī)律

1.7.1 樣品制備

選擇‘農大211’作為供試小麥，將篩選出的小麥種子用次氯酸鈉溶液浸泡滅菌，將300 g營養(yǎng)土放入8 cm×8 cm（直徑×高）的種植盆中，分別用丙硫菌唑原藥和凝膠顆粒處理土壤，其中丙硫菌唑的有效成分為15 mg/盆。在距土壤表面3 cm深處播種15顆種子，然后用自來水澆灌，以保證整個生育期的濕度，將未處理土壤作為空白對照。所有植株在（25±2）℃的光照培養(yǎng)箱條件下生長，光周期為14 h，暗期為10 h，在施藥后小麥完全發(fā)芽的當天開始采集樣品，貼好標簽，保存至-20℃冰箱備用。

1.7.2 樣品提取與凈化

參照石凱威等[15]的樣品前處理方法并進行方法改進。準確稱取5 g土壤樣品于50 mL離心管中，加入3 mL超純水和10 mL乙腈溶液提取，振蕩10 min，靜置30min，加入2g氯化鈉和2g無水硫酸鎂，振蕩5min，于4 000 r/min離心5 min，待凈化；準確稱取2 g小麥根部和地上部粉碎樣品于50 mL離心管中，加入1 mL超純水和5 mL乙腈溶液提取，振蕩10 min，靜置30 min，隨后加入1 g氯化鈉和1 g無水硫酸鎂，振蕩5 min，于4 000 r/min離心5 min，待凈化。

取上述小麥根部和土壤的上清液各1.5 mL分別放入裝有150 mg無水硫酸鎂＋50 mg C18的2 mL離心管中，渦旋30 s，于5 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22μm的有機系濾膜，待上機檢測；取上述小麥地上部的上清液1.5 mL放入裝有150 mg無水硫酸鎂＋50 mg C18＋25 mg GCB的2 mL離心管中，渦旋30 s，于5 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22μm的有機系濾膜，待上機檢測。

1.7.3 UPLC-MS/MS分析

液相色譜條件：色譜柱為Hypersil Gold C18（50 mm×2.1 mm，1.9μm）；柱溫為40℃；流動相為乙腈-0.1%甲酸水（80∶20，V/V）；流速為0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源；多反應監(jiān)測正離子掃描；毛細管電壓為3 500 V；干燥氣溫度為300℃；干燥氣流速為6 L/min；噴霧器壓力172.38 kPa；鞘流氣溫度為250℃；鞘流氣流速為5 L/min，采集參數(shù)見表2。由于丙硫菌唑在土壤和植株內極易轉化，本試驗僅研究脫硫丙硫菌唑在土壤和小麥植株中的分布情況。

表2 脫硫丙硫菌唑采集參數(shù)

1.8 數(shù)據處理

使用SPSS 26對數(shù)據進行ANOVA分析，所有數(shù)據均表示為平均值±標準差（mean±SD）；通過Duncan新復極差法對試驗獲得的數(shù)據結果進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

前期研究以載藥率和包封率為考核指標，采用L9（34）正交試驗對水凝膠微球進行了參數(shù)的優(yōu)化，篩選出適宜的條件[13]。本文將采用單因素試驗考察各個因素對水凝膠成球性、載藥率和包封率的影響，篩選出較優(yōu)的條件，并與正交試驗結果進行對比。

2.1 不同條件對CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球成型的影響

2.1.1 不同種類乳化劑對丙硫菌唑/CMCSO/W乳液穩(wěn)定性的影響

穩(wěn)定的丙硫菌唑/CMCSO/W乳液是保證復合凝膠微球具有較高載藥率和包封率的前提，若乳液體系不穩(wěn)定則會發(fā)生分層析油，影響到凝膠微球中藥物負載的均勻度及在應用中的使用效果[16]。本試驗重點考察了質量分數(shù)為2%的聚乙烯醇（PVA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、烷基酚聚氧乙烯醚（OP-10）和聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯（Tween-80）4種不同的乳化劑對混合乳液乳化穩(wěn)定性的影響（表3）。由表3可知，在4種乳化劑中，Tween-80的乳化穩(wěn)定效果相對較好，可作為制備凝膠顆粒的乳化劑；PVA具有較強的親水性，主要是起到增加黏度的作用，不宜作為該體系的乳化劑；SDS的陰離子磺酸根參與Mn2＋的配位，影響乳液的穩(wěn)定性?？煞€(wěn)定O/W乳液的乳化劑親水親油平衡值（HLB）一般在8～18，OP-10和Tween-80均滿足該要求，綜合實際乳液穩(wěn)定效果，本試驗選擇質量分數(shù)為2%的Tween-80作為制備凝膠微球的乳化劑。

表3 不同種類乳化劑對丙硫菌唑/CMCSO/W乳液穩(wěn)定性的影響

2.1.2 CMCS用量對凝膠微球成型效果的影響

在其他試驗條件固定不變的情況下，本文考察了不同質量分數(shù)的CMCS對凝膠微球成型效果的影響。結果表明，當CMCS質量分數(shù)為2%時，凝膠微球拖尾，不夠均勻與光滑；當CMCS質量分數(shù)增加到3%時，凝膠微球部分拖尾，較為均勻；當質量分數(shù)為4%時，很容易成型，易于制備，且成型效果好，顆粒均勻（圖1）。因此，本試驗選擇質量分數(shù)為4%的CMCS進行載藥水凝膠微球的制備。

圖1 CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球干燥前（a）和干燥后（b）

2.1.3 交聯(lián)劑濃度對凝膠微球成型效果的影響

在其他試驗條件固定不變的情況下，本文考察了不同Mn2＋濃度對微球成型效果的影響。結果表明，隨著Mn2＋濃度從0.05 mol/L增加到0.2 mol/L，凝膠微球越容易成型，表面越光滑。因此，本試驗選擇0.2 mol/L交聯(lián)劑進行載藥水凝膠微球的制備。

2.1.4 油水比對凝膠微球成型效果的影響

在其他條件固定不變的情況下，本文考察了不同油水體積比對微球成型效果的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同油水體積比對凝膠微球的成型并無明顯的區(qū)別。

2.2 不同條件對CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球載藥率和包封率的影響

2.2.1 乳化劑Tween-80用量對凝膠微球載藥率和包封率的影響

根據預試驗，將質量分數(shù)為2%、3%和4%的乳化劑Tween-80分別制備成凝膠顆粒，測定其經過濾干燥后得到的產物的質量、載藥率及包封率。由表4可知，隨著Tween-80用量的增加，凝膠顆粒的載藥率和包封率顯著下降，包埋率也隨之下降。Tween-80形成乳液后一部分附著在凝膠顆粒表面，另一部分分散溶于水相中。附著在顆粒表面的一部分乳化劑并不會隨著洗滌、過濾、干燥的過程而失去，但是總投入的有效成分的質量不變，因此過濾干燥后總產物質量的增加導致載藥率下降。此外，當增加表面活性劑Tween-80的用量時，部分Tween-80在水相中形成膠束，對丙硫菌唑產生增溶作用，導致原藥溶于水中，從而造成包封率的下降?；谏鲜鼋Y論，最終確定乳化劑Tween-80的質量分數(shù)為2%。

2.2.2 CMCS用量對凝膠微球載藥率和包封率的影響

CMCS具有很好的水溶性，但是當CMCS濃度到達一定程度時溶液黏度也隨之增加，影響注射器的滴加，所以本研究以乳液中CMCS的質量分數(shù)4%作為上限。當CMCS的濃度過低時，制備的凝膠微球顆粒在磁力攪拌器的攪拌下很容易破碎，無法得到完整的凝膠顆粒，故本試驗分別用質量分數(shù)為2%、3%和4%的CMCS制備凝膠顆粒，測定其載藥率和包封率，結果見表4。結果表明，CMCS的質量分數(shù)對凝膠顆粒的載藥率有顯著影響，當其質量分數(shù)為2%時，載藥率顯著高于其他水平，這是由于CMCS的質量較少，最終形成凝膠顆粒時有效成分的比重相對增大，因此載藥率顯著高于3%和4%的水平；當其質量分數(shù)為2%和4%時，丙硫菌唑的包封率之間沒有顯著區(qū)別，但低質量濃度得到的水凝膠易碎裂，干燥后得到的顆粒黏連嚴重，因此最終選用質量分數(shù)為4%的CMCS作為最適宜水平。

2.2.3 油水比對凝膠微球載藥率和包封率的影響

按照以上試驗篩選獲得的最佳條件，分別設定油水體積比為1∶7.5、1∶10和1∶15來制備凝膠微球，測定其載藥率及包封率。結果表明，油水比例對凝膠微球的載藥率影響不顯著，但對包封率有顯著影響（表4）。油相的增加或者減少都會造成最終形成的乳狀液黏度變化，乳液滴加不勻使交聯(lián)反應不能充分反應，從而導致包封率變化。本試驗最終選用的油水體積比為1∶10，此時包封率最高。

2.2.4 交聯(lián)劑濃度對凝膠微球載藥率和包封率的影響

在預試驗中，交聯(lián)劑的濃度對凝膠微球的成型具有很大的影響。本試驗選用0.05、0.1和0.2 mol/L的Mn2＋作為交聯(lián)劑，考察其對凝膠微球載藥率和包封率的影響。結果表明，凝膠微球的載藥率和包封率隨著交聯(lián)劑濃度的增加而增加（表4）。當溶液中存在大量交聯(lián)劑時，乳液可以與金屬離子迅速充分接觸，形成結構致密的凝膠顆粒，將有效成分包封在蛋殼結構中，避免丙硫菌唑被CMCS以及Tween-80的增溶作用溶解和分散到水中，從而使載藥率和包封率提升。根據試驗結果，最終選用的交聯(lián)劑濃度為0.2 mol/L。

表4 不同影響因素對CMCS-丙硫菌唑水凝膠微球載藥率和包封率的影響

通過單因素試驗研究了各個制備參數(shù)對凝膠微球成球性、載藥率和包封率的影響，并篩選出較優(yōu)的條件：乳化劑Tween-80質量分數(shù)為2%，CMCS質量分數(shù)為4%，聯(lián)聯(lián)劑濃度為0.2 mol/L，油水比為1∶10（V/V）。該試驗結果與L9（34）正交試驗篩選的結果一致。在優(yōu)化條件下，所得凝膠微球的載藥率和包封率分別為22.17%±0.83%和68.38%±2.56%。

2.3 劑量傳輸分布研究

2.3.1 方法的線性范圍與定量限

配置系列脫硫丙硫菌唑的標準工作溶液，作基質標準曲線。脫硫丙硫菌唑在土壤、小麥根部以及小麥地上部基質中的線性方程、線性范圍和相關系數(shù)，見表5。當土壤中添加濃度為0.025 mg/kg時，脫硫丙硫菌唑的平均回收率為88%；當小麥根部和小麥地上部中添加濃度為0.01 mg/kg時，脫硫丙硫菌唑的平均回收率分別為98%和102%，且信噪比大于10（S/N＞10），因此土壤中方法定量限設定為0.025 mg/kg，小麥根部和地上部中的方法定量限設定為0.01 mg/kg。

表5 樣品中脫硫丙硫菌唑的線性范圍、線性方程、添加回收率和精密度（n=5）

2.3.2 回收率和精密度

采用不含脫硫丙硫菌唑的土壤和小麥樣品進行添加回收和精密度試驗，樣品添加3個濃度水平0.05、0.5、1 mg/kg，每個添加濃度平行測定5次，用UPLC-MS/MS進樣測定。在土壤中，3個添加水平的平均回收率為88.0%～111.8%；在小麥根中，3個添加水平的平均回收率為98.0%～104.2%；在小麥地上部中，3個添加水平的平均回收率為99.8%～101.6%，相對標準偏差均小于7.2%，結果見表5。

2.3.3 樣品中劑量測定分析

不同時間段的土壤、小麥不同部位中的脫硫丙硫菌唑的劑量分布情況如圖2所示。在采樣的第1 d（以小麥發(fā)芽的第1 d計），用丙硫菌唑原藥處理的土壤、小麥根部和地上部中的脫硫丙硫菌唑含量高于凝膠顆粒處理的對應樣品中的含量，說明凝膠顆粒具有緩釋的效果，有助于降低丙硫菌唑在土壤、植株中的轉化。對于原藥和凝膠顆粒處理，不同部位的脫硫丙硫菌唑含量分布情況依次為土壤＞根部＞地上部，說明大部分丙硫菌唑存在于土壤中，內吸傳導的劑量僅占投入劑量的小部分。在丙硫菌唑原藥與凝膠顆粒處理后的土壤中，脫硫丙硫菌唑的劑量分布具有顯著差異性，隨著采樣周期的延長，其含量逐漸增加，證明丙硫菌唑在土壤中脫硫轉化較快，而凝膠化后可以降低丙硫菌唑的脫硫轉化情況。

注：“*”表示在P＜0.05水平上差異性顯著。

在小麥根部中，凝膠顆粒處理的脫硫丙硫菌唑劑量與丙硫菌唑原藥處理相比在前期差異顯著，但21 d后差異不顯著，說明脫硫產物在小麥的根部發(fā)生了轉化。在小麥地上部分，凝膠顆粒處理的脫硫丙硫菌唑劑量與丙硫菌唑原藥處理相比在前期差異顯著，隨后逐漸趨于平衡，說明凝膠化可以緩慢釋放有效成分。因此，丙硫菌唑凝膠顆粒對于延長丙硫菌唑的持效期具有重要意義。

3 結 論

本文利用乳化交聯(lián)法成功制備了負載丙硫菌唑的金屬錳基羧甲基殼聚糖水凝膠，并通過單因素試驗篩選出合適的制備參數(shù)：乳化劑Tween-80質量分數(shù)為2%；CMCS質量分數(shù)為4%；交聯(lián)劑濃度為0.2 mol/L；油水比為1∶10（V/V）。在優(yōu)化條件下，所得丙硫菌唑緩釋復合水凝膠微球的載藥率為22.17%±0.83%，包封率為68.38%±2.56%。盆栽試驗結果表明，丙硫菌唑凝膠化有助于降低丙硫菌唑在土壤、小麥植株中的脫硫代謝轉化，有望提升丙硫菌唑的應用性能。這種基于金屬離子和天然多糖制備的多功能水凝膠在農業(yè)生產中顯示出潛在的應用前景，可拓寬目前農藥控制釋放制劑的研究領域，有望在農藥的可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用。