叢培芳， 劉 穎， 史秀云， 馬瑞珩， 金紅旭

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110016

爆震傷是指高速?zèng)_擊波對人體器官和組織造成的損傷，可導(dǎo)致內(nèi)傷和外傷。在各種損傷中，發(fā)生率較高的是沖擊波造成的肺損傷和腦損傷[1]。沖擊波可使腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生認(rèn)知障礙和情緒焦慮，其中涉及多種機(jī)制[2]。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是從紅酒、葡萄、漿果、虎杖、結(jié)縷草中提取的活性提取物[3]，具有多種功能，如抗炎、抗氧化、抗癌、保護(hù)心血管等[4-5]。RES可抑制核因子(nuclear factor，NF)-κB的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6的表達(dá)[6]。有研究報(bào)道，RES可減輕小鼠腦出血后的神經(jīng)炎癥，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。Xie等[8]發(fā)現(xiàn)，RES可通過抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦損傷。在創(chuàng)傷性腦損傷中，RES可通過上調(diào)Sirt1增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]。本研究旨在觀察RES對沖擊波致小鼠腦組織炎癥損傷的影響，并探討其可能的分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 30只健康雄性C57BL/6小鼠購自沈陽艾科賽斯生物科技有限公司；RES購自西安高遠(yuǎn)生物科技有限公司；IL-1β和IL-6的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司； 高遷移率族蛋白B(high mobility group box 1，HMGB1)、toll樣受體(toll-like receptors，TLR)4、TNF-α、S100β、NF-κB抗體購自英國Abcam公司。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分入對照組(Control組)、爆震組(Blast組)、爆震+給藥組(RES組)，每組各10只。采用自主研發(fā)的爆震傷裝置建立小鼠腦損傷模型，沖擊波強(qiáng)度為(115.8±10.4)PSI。小鼠提前1 d禁食水，用2%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)腹腔麻醉小鼠，將Blast組和RES組置于防護(hù)裝置內(nèi)進(jìn)行頭部爆震。RES組于建模前1周給予30 mg/kg RES干預(yù)， 腹腔注射，每天1次。于爆震后24 h麻醉處死所有小鼠，收集血清及腦組織標(biāo)本。采用HE染色，觀察小鼠腦組織病理學(xué)改變。

1.2.2 Y迷宮 采用Y迷宮測試爆震后24 h小鼠的記憶能力。在測試的前1 d，小鼠需要接受訓(xùn)練。禁食過夜后，將小鼠放入起始臂自由探索并找到食物臂。每天接受2次訓(xùn)練，每次5 min。然后繼續(xù)禁食到第2天進(jìn)行測試。在測試階段，任何手臂都沒有食物。將1只小鼠放在Y迷宮的起始臂，讓其自由移動(dòng)5 min，監(jiān)測食物臂的進(jìn)入和持續(xù)時(shí)間。

1.2.3 HE染色 將取材的腦組織在室溫下固定在10%甲醛緩沖液中，并通過徠卡微系統(tǒng)組織處理器(ASP 300S，德國)將其包埋在石蠟中。進(jìn)行4 μm厚的切片后，HE染色并在光學(xué)顯微鏡下檢查。

1.2.4 ELISA檢測 將血清在4℃融化，按說明書所示，與標(biāo)準(zhǔn)品一起加入到抗原包被的96孔板中，37℃孵育，甩干。加入Detection A溶液孵育30 min，甩干洗板后再加入Detection B溶液孵育30 min，甩干洗板后顯色。檢測每個(gè)孔的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清內(nèi)所含IL-1β和IL-6的濃度。

1.2.5 Western blot檢測 采用Western blot技術(shù)檢測腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白及炎癥相關(guān)蛋白TNF-α、S100β的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠沖擊后Y迷宮結(jié)果比較 與Control組比較，Blast組進(jìn)入食物臂的次數(shù)和位于食物臂的總時(shí)間顯著減少(P<0.05)。與Blast組比較，RES組在食物臂的進(jìn)入次數(shù)有所增加，在食物臂的總時(shí)間明顯延長(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠沖擊后Y迷宮結(jié)果比較

2.2 各組小鼠沖擊后炎癥反應(yīng)比較 與Control組比較，Blast組小鼠血清內(nèi)炎癥因子IL-1β和IL-6明顯升高(P<0.05)。與Blast組比較，RES組小鼠血清內(nèi)炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠沖擊后炎癥反應(yīng)比較

2.3 各組小鼠沖擊后腦組織病理改變比較 與Control組比較，Blast組小鼠腦組織內(nèi)存在細(xì)胞變性和炎癥細(xì)胞浸潤。與Blast組比較，RES組小鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞變性明顯緩解，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕。見圖3。

圖3 各組小鼠沖擊后腦組織病理改變比較

2.4 各組小鼠沖擊后腦組織內(nèi)炎癥相關(guān)蛋白比較 與Control組比較，Blast組小鼠腦組織內(nèi)炎癥相關(guān)蛋白TNF-α和S100β明顯升高(P<0.05)。與Blast組比較，RES組小鼠腦組織內(nèi)炎癥相關(guān)蛋白TNF-α和S100β明顯降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組小鼠沖擊后腦組織內(nèi)炎癥相關(guān)蛋白比較

2.5 各組小鼠沖擊后腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路表達(dá)比較 與Control組比較，Blast組小鼠腦組織內(nèi)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。與Blast組比較，RES組小鼠腦組織內(nèi)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠沖擊后腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路表達(dá)比較

3 討論

近年來，煤氣爆炸及化學(xué)爆炸等各種社會(huì)事件的發(fā)生使得爆震傷在平民中的發(fā)生逐漸增多，沖擊波所致的腦損傷會(huì)影響人們的記憶并造成功能不全，給家庭和社會(huì)造成很大負(fù)擔(dān)。因此，了解其中涉及的病理生理機(jī)制和開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。

RES作為一種天然活性成分已被廣泛研究。除了抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物活性外，還被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用。有研究報(bào)道，RES可以通過調(diào)節(jié)線粒體蛋白質(zhì)、3-硝基酪氨酸、4-羥基壬烯酸的氧化損傷以及線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性，從而對癲癇癥產(chǎn)生有益影響[10]。Malaguarnera等[11]發(fā)現(xiàn)，RES可顯著減弱炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。本研究觀察到RES能夠改善血清炎癥因子水平和腦組織炎癥，同時(shí)可使沖擊波引起的記憶能力下降得到緩解。

TLR4是一種模式識別受體，在檢測保守的致病相關(guān)分子模式和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式中具有重要作用。HMGB1是一種廣泛表達(dá)的非組蛋白核蛋白，能夠激發(fā)和放大腦外傷后的非感染性炎癥反應(yīng)[12]。炎癥細(xì)胞分泌后，HMGB1可與小膠質(zhì)細(xì)胞上的TLR4相互作用，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，激活髓系分化因子88信號，導(dǎo)致NF-κB移位到細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄[13]。NF-κB是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，存在于幾乎所有類型的動(dòng)物細(xì)胞中，參與炎癥、凋亡、免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長和發(fā)育等過程。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NF-κB信號可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞并產(chǎn)生促炎因子，在神經(jīng)元損傷的細(xì)胞反應(yīng)和突觸可塑性中起著重要的生理作用[14]。還有研究表明，通過調(diào)節(jié)HMGB1/NF-κB易位可減輕脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥及其產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。Le等[15]發(fā)現(xiàn)，RES通過激活SIRT1抑制HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB信號和隨后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，在新生兒缺氧缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RES處理可抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路，降低TNF-α和S100β蛋白表達(dá)，對小鼠腦損傷引起的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。

綜上所述，RES干預(yù)對沖擊波致小鼠腦組織炎癥損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)。