劉 穎， 叢培芳， 史秀云， 馬瑞珩， 金紅旭

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110016

爆炸可造成機體多器官損傷，其嚴(yán)重程度與爆炸物的類型和數(shù)量、距離爆炸點的距離、爆炸環(huán)境、受害者的防護(hù)情況及健康狀況等有關(guān)[1]。爆炸瞬間沖擊波作用于不同密度交界面后，通過內(nèi)爆、剝落、慣性、負(fù)壓等效應(yīng)導(dǎo)致組織器官損傷，其中以空腔器官(如耳、肺、胃腸等)損傷最為嚴(yán)重[2-3]。0.3%～0.6%爆震傷幸存者會發(fā)生胃腸道損傷，出現(xiàn)不同性質(zhì)和強度的疼痛、惡心、嘔吐、腹瀉、里急后重、便血、嘔血、腸鳴音消失、壓痛、反跳痛等。胃腸道沖擊傷還會導(dǎo)致延遲性胃腸道穿孔。爆震致腸道損傷常被腦、胸部及四肢等嚴(yán)重?fù)p傷所掩蓋，造成診斷延誤。但目前對爆震致腸道損傷的特點、相關(guān)基因和蛋白在其中的作用及機制尚不清楚[4-5]。本研究旨在探討CD28基因在爆震致腸道損傷中的作用及機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 16只健康雄性C577BL/6小鼠購自遼寧長生生物科技有限公司；16只健康雄性CD28基因敲除小鼠來自杰克遜實驗室(薩克拉門托，美國)。小鼠體質(zhì)量(22±3)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將C577BL/6小鼠隨機分入正常對照組(n=8)和爆震傷模型組(n=8)，將CD28基因敲除小鼠隨機分入CD28基因缺失組(n=8)和PI3K抑制劑組(n=8)。模型建立時，爆震傷模型組、CD28基因缺失組、PI3K抑制劑組小鼠腹部直接接受沖擊波損傷，實驗瞬時沖擊波超壓為(342±32)PSI。PI3K抑制劑組Ly294002通過小鼠腹腔注射100 mM溶于100 μl生理鹽水。

1.2 小鼠觀察和體質(zhì)量測量 模型建立前后每日觀察小鼠狀態(tài)，模型建立前后每日測量小鼠體質(zhì)量2次并取得平均值，記錄小鼠體質(zhì)量變化趨勢。

1.3 HE染色 爆震48 h后，取各組小鼠腸道組織，生理鹽水清洗后置于福爾馬林中固定，脫水包埋并切成5 μm厚組織切片，梯度脫蠟后，蘇木素染色3.0 min，伊紅染液染色1.5 min，二甲苯和梯度酒精透明，封片后顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 TUNEL檢測 爆震48 h后，取各組小鼠腸道組織，生理鹽水清洗后置于福爾馬林中固定，脫水包埋并切成4 μm厚組織切片，根據(jù)TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Western-blot檢測 取凍存腸道組織提取總蛋白進(jìn)行濃度測定后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)模封閉后，分別用丙二醛(malonaldehyde，MDA)(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)-1(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、SOD-2(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、Phospho-PI3 Kinase p85(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、AKT(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、Nrf2(Rabbit monoclonal IgG，1∶1 000)及GAPDH(Mouse monoclonal IgG，1∶1 000)4℃孵育過夜，相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 h后采用ECL發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行蛋白顯影及灰度測定。

2 結(jié)果

2.1 小鼠觀察和體質(zhì)量測量 建模前：各組小鼠狀態(tài)良好，飲食和排便正常。建模后：爆震傷模型組小鼠活動減少，無排便或排便稀軟；與爆震傷模型組比較，CD28基因缺失組小鼠活動狀態(tài)和排便趨于正常；PI3K抑制劑組狀態(tài)與爆震傷模型組接近。爆震傷模型組小鼠建模前和建模后24、48 h的體質(zhì)量分別為(23.7±3.5)g、(19.3±2.8)g、(18.4±2.9)g，呈持續(xù)降低趨勢(P<0.05)；CD28基因缺失組小鼠建模前和建模后24、48 h的體質(zhì)量分別為(23.1±2.6)g、(22.2±3.7)g、(23.8±3.3)g，先降低后升高，比爆震傷模型組更趨近于正常(P<0.05)；PI3K抑制劑組小鼠建模前和建模后24、48 h的體質(zhì)量分別為(23.5±3.2)g、(19.6±3.1)g、(18.9±2.5)g，變化趨勢與爆震傷模型組相近(P>0.05)。

2.2 HE染色和TUNEL檢測結(jié)果 爆震傷模型組小鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)松散破壞，可見明顯腸道損傷，絨毛發(fā)生萎縮和斷裂，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，上皮樣腺體數(shù)量減少；CD28基因缺失組小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)趨向于正常，形態(tài)結(jié)構(gòu)相對整齊，與爆震傷模型組比較，炎癥細(xì)胞浸潤減少，腸道絨毛高聳，上皮、黏膜及絨毛損傷減輕；PI3K抑制劑組小鼠腸道變化趨近于爆震傷模型組。爆震傷模型組小鼠凋亡細(xì)胞的紅色熒光強度高于CD28基因缺失組，即爆震可致小鼠腸道組織凋亡損傷；PI3K抑制劑組小鼠腸道組織凋亡損傷程度趨近于爆震傷模型組。見圖1。

圖1 HE染色和TUNEL檢測結(jié)果(a.HE染色，b.TUNEL檢測)

2.3 Western-blot檢測 與正常對照組小鼠比較，爆震傷模型組腸道組織中MDA蛋白表達(dá)升高，SOD-1和SOD-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與爆震傷模型組小鼠比較，CD28基因缺失組MDA蛋白表達(dá)降低，SOD-1和SOD-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；PI3K抑制劑組MDA、SOD-1、SOD-2蛋白表達(dá)趨近于爆震傷模型組(P>0.05)。見圖2。與正常對照組小鼠比較，爆震傷模型組腸道組織中PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與爆震傷模型組小鼠比較，CD28基因缺失組PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；PI3K抑制劑組小鼠PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達(dá)低于CD28基因缺失組(P<0.05)，趨近于爆震傷模型組(P>0.05)。見圖3。

圖2 各組MDA、SOD-1、SOD-2蛋白表達(dá)

圖3 各組PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達(dá)

3 討論

爆震受害者通常具有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，因其傷害直接或間接地與爆炸產(chǎn)生的沖擊波有關(guān)。這些傷害取決于爆炸裝置的類型、爆炸時的環(huán)境、受害者的情況等[6]。爆震沖擊波作用于機體可造成空腔臟器的嚴(yán)重?fù)p傷，機制較為復(fù)雜。體外的爆炸能轉(zhuǎn)化為生物動力能，在超壓下對腹部造成損傷；此外，當(dāng)壓力瞬態(tài)與機體相互作用時，部分激波被反射，但大多被吸收，軟組織、血管及充滿空氣或液體的腔室(如肺、腸、腦等)之間的界面特別容易受到損傷。臟器發(fā)生損傷后，相關(guān)的蛋白改變同樣在爆震損傷中發(fā)揮重要作用[7-8]。CD28是免疫應(yīng)答啟動、維持及下調(diào)中的關(guān)鍵因素。有研究表明，CD28可刺激T細(xì)胞，除T細(xì)胞受體外，還會為各種白細(xì)胞介素的產(chǎn)生提供強有力的信號，引發(fā)炎癥反應(yīng)瀑布[9]。CD28拮抗劑能夠明顯降低白細(xì)胞介素-6、環(huán)氧化酶-2的表達(dá)和巨噬細(xì)胞的數(shù)量，減輕輻射引起的小鼠腸道損傷。既往研究發(fā)現(xiàn)，CD28基因缺失可減輕胸部沖擊波暴露導(dǎo)致的腦部損傷，因此，CD28基因在沖擊波導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、繼發(fā)的氧化應(yīng)激和凋亡中均發(fā)揮重要作用[10]。本研究同樣證實，CD28基因通過PI3K/AKT/Nrf2通路參與爆震致腸道氧化應(yīng)激和凋亡損傷，且在給予PI3K抑制劑后相關(guān)作用減弱。作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶的一個家族，PI3K參與多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖、分化、存活及細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)取Ｗ鳛橐环N上游信號，CD28能夠募集PI3K、Grb2、Gads等相關(guān)蛋白，通過調(diào)節(jié)一系列抗氧化劑和細(xì)胞應(yīng)激基因參與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡反應(yīng)[11-12]。正常條件下，Nrf2通過快速泛素化和蛋白酶體依賴性降解維持在低水平。活性氧的過度積累會影響多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞解離Nrf2。隨后，CAT、TRX、SOD、NADPH脫氫酶醌1等氧化劑和抗氧化酶被進(jìn)一步激活[13]。本研究中，在爆炸暴露后，腸內(nèi)氧化酶和抗氧化酶水平發(fā)生了明顯變化，反映了腸組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而CD28基因敲除可以減弱這些變化。

綜上所述，CD28基因在爆震致腸道損傷中發(fā)揮重要作用，其機制可能與PI3K/AKT/Nrf2通路有關(guān)，該通路相關(guān)蛋白可為爆震致腸道損傷的進(jìn)一步救治策略研究提供相應(yīng)基因和蛋白靶點。