亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        荷載JQ1/紫杉醇 PLGA納米粒的制備

        2022-04-08 05:34:22劉騫王沐芳侯哲王韶鴻王慎興王鵬劉芷萱趙靜郝吉福
        山東科學 2022年2期
        關鍵詞:血漿粒徑納米

        劉騫,王沐芳,侯哲,王韶鴻,王慎興,王鵬,劉芷萱,趙靜, 郝吉福*

        (1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)藥學院,山東 泰安 271016;2.山東省泰山療養(yǎng)院(山東省泰山醫(yī)院),山東 泰安 271016)

        近年來針對腫瘤開展的免疫治療倍受關注,但腫瘤細胞表面的程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)會與細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)上程序性死亡受體1(programmed cell death receptor 1,PD-1)相互結合,耗竭CTL的功能,產(chǎn)生免疫逃逸,降低其對腫瘤的殺傷作用[1-2]。JQ1作為溴結構域蛋白(bromodomain containing protein 4,BRD4)的有效抑制劑,能夠降低PD-L1在腫瘤細胞表面的表達,解除腫瘤細胞對CTL的免疫抑制[3-5]。紫杉醇(paclitaxel,PTX)作為一線抗腫瘤藥物,其療效在肺癌、乳腺癌等臨床治療中得到證實。因此,本文提出聯(lián)合應用兩種藥物,一方面通過PTX殺傷腫瘤細胞釋放腫瘤抗原激活抗腫瘤免疫反應,另一方面利用JQ1降低腫瘤細胞表面PD-L1的表達解除免疫抑制,共同發(fā)揮抗腫瘤的免疫治療。然而,由于JQ1和PTX水溶性差,難以制成注射劑而限制了其應用。納米制劑在改善難溶性藥物的溶解性,實現(xiàn)系統(tǒng)遞藥和提高生物利用度方面發(fā)揮著重要作用[6-7]。本研究擬以高分子聚合物材料聚乳酸(PLA)-羥基乙酸(PGA)共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)為載體,將PTX和JQ1荷載于PLGA納米粒中,實現(xiàn)兩種藥物的共同遞送,以期發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。

        1 儀器和材料

        1.1 儀器

        JY92-Ⅱ探頭式超聲波粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);K30超速離心機(德國Sigma公司);Mastersizer 3000激光粒度分析儀(英國馬爾文公司);VP-10A plus高效液色譜儀(日本島津公司);FDU-1200臺式冷凍干燥機(日本東京理化株式會社);流式細胞儀(美國BD公司)。

        1.2 藥品和試劑

        1.3 動物

        雄性SD大鼠,體重(230 g±20 g),購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,合格證號SCXY(魯)20140007。

        2 方法和結果

        2.1 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒的制備

        采用超聲乳化溶劑蒸發(fā)法制備荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒[8-9]。精密稱取10 mg PTX、5 mg JQ1與 200 mg PLGA,將三者溶于4.5 mL乙酸乙酯中,形成有機相(作為油相); 精密量取含有2.5 mg/mL的PVA水溶液20.0 mL作為水相,將油相與水相混合后,置于探頭式超聲波粉碎儀中,維持功率400 W條件下進行超聲3 min,使形成外觀均勻的乳濁液。將該乳濁液置于磁力攪拌器中不斷攪拌,以除去有機溶劑。隨后將所得到的納米混懸劑進行超速離心15 min(12 000 r/min),棄去含有游離藥物的上清液后將沉淀物用蒸餾水分散,洗滌兩次,同法離心收集沉淀,制備成荷載PTX/JQ1 的PLGA納米粒,經(jīng)冷凍干燥后備用。

        2.2 PLGA納米粒的粒徑測定及形貌觀察

        取0.5 mL所制備的荷載PTX/JQ1 的PLGA納米?;鞈乙海捎眉す饬6确治鰞x測定粒度和多分散指數(shù)(polydispersion index, PDI);另將所制備的PLGA納米粒適度稀釋,滴加在覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上,干燥后以2%磷鎢鉬酸進行負染制樣,采用透射電鏡觀察其外觀形貌。所測定的PLGA納米粒粒徑結果如圖1(a)所示,其粒徑呈單峰正態(tài)分布,平均粒徑大小為210 nm左右,PDI為0.153(<0.3),提示分散性良好,粒徑大小較為均勻。由透射電鏡結果圖1(b)可以看出,所制備的PLGA納米粒外觀呈圓整、規(guī)則的球狀結構,表面無黏連。

        圖1 荷載PTX/JQ1 的PLGA納米粒粒徑及透射電鏡圖

        2.3 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒的包封率及載藥量測定

        所測得的PTX的標準曲線方程為:A=26 956C-5 078(r=0.999 9),表明PTX在0.5~25.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好;JQ1的標準曲線方程為:A=37 982C-13 470(r=0.999 2),表明 JQ1在1.25~25.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好。由標準曲線及所測得的峰面積分別計算PTX和JQ1在凍干粉中的含量,作為PLGA納米粒中被包載的藥物量M包載。另根據(jù)處方中所投藥量M總量及所用PLGA的重量MPLGA,分別按公式(1)計算包封率(entrapment efficiency,pEE)與載藥量(drug loading,qDL)。

        (1)

        經(jīng)式(1)計算,可知PLGA納米粒中PTX的包封率及載藥量分別為(70.77±5.65)%,(6.43±0.51)%,(n=3);JQ1的包封率及載藥量分別為(57.3±4.31)%,(5.21±0.27)%,(n=3)。

        2.4 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒大鼠體內(nèi)藥動學分析

        2.4.1 給藥方法及血樣處理

        取體重230 g左右的SD大鼠6只,給藥前一晚撤去飼料,禁食 12 h 以上,保持自由飲水。尾靜脈注射所制備的荷載PTX/JQ1的PLGA納米?;鞈乙?,給藥劑量為4 mg/kg,分別在給藥后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8 h于眼內(nèi)眥處取血約0.3 mL,置肝素化離心管中,3 000 r/min離心 10 min,分取血漿。精密吸取血漿100 μL,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,精密加入色譜純乙腈300 μL,渦旋混合3 min,12 000 r/min高速離心10 min,吸取上清液20 μL,采用高效液相色譜(HPLC)法測定PTX和JQ1的含量。

        2.4.2 血漿樣品中PTX和JQ1含量測定方法

        高效液相色譜條件同2.3項下PTX和JQ1測定方法。分別取實驗大鼠的空白及含藥血漿各 100 μL,按2.4.1項下血漿樣品處理方法進行處理后,進行方法專屬性考察。結果表明血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾PTX和JQ1的測定,PTX和JQ1色譜峰的保留時間分別為6.5 min及14.5 min,結果見圖2。

        圖2 血漿樣品中PTX和JQ1的HPLC譜圖

        2.4.3 藥時曲線與數(shù)據(jù)處理

        將所測血漿樣品的峰面積代入標準曲線方程,計算不同時間點的血藥濃度,繪制藥時曲線,結果見圖3。將所測得的藥時數(shù)據(jù)經(jīng)DAS(drug and statistics)藥動學軟件進行隔室模型擬合處理,以擬合度、AIC(Akaike′s information criterion)確定合適的模型。擬合的藥時曲線方程為:

        圖3 大鼠尾靜脈注射PLGA納米粒后PTX與JQ1血藥濃度-時間曲線(n=6)

        CPTX=7.26e-4.85t+0.87e-0.13t,

        (2)

        CJQ1=2.04e-4.07t+0.96e-0.29t。

        (3)

        測得PTX與JQ1主要的藥動學參數(shù)如下:分布相半衰期(t1/2α)為0.142 8、0.169 9 h,消除相半衰期(t1/2β)為5.27、2.37 h,血藥濃度曲線下面積(AUC)為8.155、3.793(μg·h)/mL,清除率(CL)為122.612、131.795 mL/(h·kg),表觀分布體積(V)為766.07、396.25 mL/kg。

        2.5 對B16黑色素瘤細胞PD-L1的影響

        2.5.1 細胞接種

        取對數(shù)生長期的B16細胞,經(jīng)胰酶消化后,1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,收集細胞,以體積分數(shù)10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基制成細胞懸液,計數(shù)后以1×104個/孔的數(shù)目接種到無菌24孔板中,每孔添加1 mL含血清培養(yǎng)基,置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),至單層細胞覆蓋率到達70%~80% 時,進行加藥共培養(yǎng)。

        2.5.2 給藥方案

        實驗分組共分為六組:①為對照組(記為Untreated);②為0.5 μg/mL 的JQ1混懸液組(記為JQ1-S 0.5):稱取2.0 mg JQ1溶解在少量(<0.1 %)DMSO中,用培養(yǎng)基稀釋成濃度為0.5 μg/mL,加入培養(yǎng)孔中與細胞共培養(yǎng);③為0.25 μg/mL的JQ1混懸液組(記為JQ1-S 0.25);④為0.5 μg/mL 的PLGA納米粒組(記為JQ1-P 0.5):取制備的荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒凍干粉分散在培養(yǎng)基中,再稀釋至濃度為0.5 μg/mL,加入培養(yǎng)板中與細胞共培養(yǎng);⑤為0.25 μg/mL的PLGA納米粒組(記為JQ1-P 0.25)。細胞添加含藥培養(yǎng)基后共培養(yǎng)72 h,期間間隔36 h換液一次。

        2.5.3 細胞染色與檢測

        將培養(yǎng)72 h后的細胞棄去上層培養(yǎng)基,洗滌、消化、離心收集細胞。轉(zhuǎn)移至96孔板中,加入封閉液封閉。隨后加入50 μL配制好的表面抗體CD274-PE,混合均勻,4 ℃避光染色15 min,離心、洗滌除去多余抗體染液,最后加入A430進行染色。將染色完成的細胞進行流式細胞術分析,數(shù)據(jù)結果采用FlowJo軟件進行處理,分析策略及PD-L1的抑制情況見圖4。

        B16細胞表面存在的PD-L1蛋白也被稱為表面抗原分化簇274(CD274)。由圖4(b)可知對照組CD274表達量最高,表明腫瘤細胞表面存在著PD-L1的表達;但經(jīng)JQ1和PLGA納米粒組處理后,均可降低B16黑色素瘤細胞表面PD-L1的表達,然而在同等濃度條件下JQ1與PLGA納米粒組對腫瘤細胞表面PD-L1的影響沒有統(tǒng)計學差異,表明將JQ1制備成納米粒后,不影響JQ1的活性,仍能抑制PD-L1的表達。但在不同濃度下對抑制PD-L1表達情況存在著量效關系,有統(tǒng)計學差異(P<0.001)。

        圖4 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒對PD-L1抑制情況

        3 討論

        本實驗采用可生物降解高分子材料PLGA,構建了共荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒遞送系統(tǒng),利用PTX的化療作用誘導腫瘤細胞死亡釋放抗原,結合免疫檢查點抑制劑JQ1增強抗腫瘤免疫效應,以期改善模型藥物PTX/JQ1難溶性及解決兩者合用共遞送的制劑問題。利用載體材料PLGA溶于有機溶劑不溶于水的特征,與模型藥物共溶于有機溶劑后,分散到含有乳化劑的水相中,形成乳濁液,通過蒸發(fā)去除有機溶劑,使藥物與載體材料溶解度降低析出固體,從而形成骨架型PLGA納米粒遞送系統(tǒng)。前期研究表明通過改變處方中載體材料PLGA及乳化劑的濃度,以及超聲功率、超聲時間等制備工藝可以控制納米粒的粒度大小[10-11]。因此,所制備的PLGA納米??梢宰鳛閮煞N藥物共遞送的傳輸載體。

        由于所制備PLGA納米粒的平均粒徑為210 nm,符合靜脈注射給藥的要求,納米粒進入體循環(huán)后,依靠滲透滯留增強的EPR效應到達腫瘤部位,隨后PLGA納米粒降解釋放藥物發(fā)揮治療作用[12]。在藥動學研究中,利用DAS藥動學軟件按照不同隔室進行模型擬合,發(fā)現(xiàn)二室模型的 AIC 值最小,提示經(jīng)尾靜脈注射荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒后,藥物在大鼠體內(nèi)動力學特征符合二室模型。

        在腫瘤的發(fā)生與進展過程中,腫瘤細胞表面蛋白PD-L1能與T細胞表面的PD-1結合,產(chǎn)生抑制信號,耗竭T細胞正常功能,進而產(chǎn)生免疫逃逸。而B16細胞用JQ1處理后,可顯著減少細胞表面免疫抑制蛋白PD-L1的表達,提示JQ1可以通過降低PD-L1的表達解除免疫抑制,恢復機體抗腫瘤功能正常化,進而與紫杉醇聯(lián)用,通過殺傷腫瘤細胞釋放腫瘤抗原,激活機體免疫系統(tǒng),共同發(fā)揮對腫瘤的治療作用[13-14]。針對聯(lián)合療法治療腫瘤的特點,今后尚需完成荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒動物體內(nèi)抗腫瘤效果及作用機制的評價。

        猜你喜歡
        血漿粒徑納米
        納米潛艇
        糖尿病早期認知功能障礙與血漿P-tau217相關性研究進展
        木屑粒徑對黑木耳栽培的影響試驗*
        血漿置換加雙重血漿分子吸附對自身免疫性肝炎合并肝衰竭的細胞因子的影響
        基于近場散射的顆粒粒徑分布測量
        CHF患者血漿NT-proBNP、UA和hs-CRP的變化及其臨床意義
        納米SiO2的制備與表征
        腦卒中后中樞性疼痛相關血漿氨基酸篩選
        Oslo結晶器晶體粒徑分布特征的CFD模擬
        SAPO-56分子篩的形貌和粒徑控制
        国产成人亚洲精品电影| 亚洲 自拍 另类 欧美 综合| 在线日本看片免费人成视久网| 美腿丝袜诱惑一区二区| 国产成人亚洲精品无码青| 一本色道无码不卡在线观看| 中文字幕亚洲精品无码| 一区二区三区乱码在线 | 欧洲| 97久久精品亚洲中文字幕无码| 久久人人妻人人做人人爽| 亚洲综合性色一区| 精品国偷自产在线不卡短视频| 极品美女尤物嫩模啪啪| 白嫩少妇在线喷水18禁| 一区二区高清免费日本| 91九色成人蝌蚪首页| 蜜桃日本免费看mv免费版| 免费无码黄动漫在线观看| 亚洲黄色电影| 天天狠天天透天干天天| 欧洲乱码伦视频免费| 亚洲一区二区三区偷拍自拍 | 中文字幕免费观看视频| 亚洲精品AⅤ无码精品丝袜无码| 亚洲一区二区视频蜜桃| 永久中文字幕av在线免费| 黄色av一区二区在线观看| 国产免费艾彩sm调教视频| 国产全肉乱妇杂乱视频| 樱花AV在线无码| 特黄三级一区二区三区| 青草久久婷婷亚洲精品| 欧洲熟妇色xxxx欧美老妇性| 久久久国产精品黄毛片| 亚洲乱妇老熟女爽到高潮的片| 中文字幕亚洲精品人妻| 亚洲一区二区三区精品久久av| 亚洲精品国产精品乱码视色| 国产做国产爱免费视频| 日韩内射美女人妻一区二区三区 | 国产探花在线精品一区二区 |