唐志強(qiáng)，李小麗，許小涵，蒲高斌，2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355)

金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效。目前，中國(guó)新冠肺炎疫情雖然整體得到了有效的控制，但是國(guó)內(nèi)個(gè)別地區(qū)仍有反復(fù)，國(guó)際形勢(shì)依然非常嚴(yán)峻。金銀花為清熱類藥物，通過(guò)發(fā)揮清熱解毒、疏風(fēng)散熱等功效，起到防御病毒的作用，成為各個(gè)省份使用頻率較高的中藥之一，社會(huì)需求也隨之不斷加大[1]。病蟲(chóng)害是導(dǎo)致金銀花產(chǎn)量不高、質(zhì)量不穩(wěn)的主要原因，因此急需培育出優(yōu)良種質(zhì)來(lái)提高金銀花的產(chǎn)量、質(zhì)量和抗病蟲(chóng)害能力，滿足社會(huì)需求。

基因編輯是改良品種、創(chuàng)新種質(zhì)的新方法，已在多個(gè)物種中成功應(yīng)用。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)因?yàn)槠涓咝Ш?jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為目前功能基因研究及種質(zhì)改良的主要工具。在水稻中過(guò)表達(dá)OsPPDK基因，能夠在種子形成時(shí)期提高葉片的光合效率，促進(jìn)衰老葉片的N活化，在延緩葉片衰老的同時(shí)提升水稻的持綠性，為增加水稻產(chǎn)量打下了基礎(chǔ)[2]。Wang等[3]利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成攜帶TaMLO-A1等位基因突變的轉(zhuǎn)基因小麥植株，提高抗白粉病能力的同時(shí)增加了小麥的產(chǎn)量。Do等[4]通過(guò)編輯大豆FAD2-1A和FAD2-1B基因，將油酸含量增加了80%，亞油酸含量下降到1.3%～1.7%，改善了種子油脂的性狀，創(chuàng)造出高油酸大豆。U6RNA是一種小的非編碼RNA，廣泛參與mRNA前體的剪接成熟[5]。U6RNA所對(duì)應(yīng)的U6啟動(dòng)子通常被用來(lái)驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的重要組成部分。目前，U6啟動(dòng)子已在多種植物的CRISPR/Cas9系統(tǒng)中使用，包括蘋(píng)果[6]、藜麥[7]、大豆[8]、地錢[9]等。藏旭陽(yáng)等[10-11]利用海島棉的U6啟動(dòng)子構(gòu)建GbU6-1P啟動(dòng)子并且利用PEG瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將核心片段轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中，篩選出GbU6-7P啟動(dòng)子，以GGB為靶序列構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體并成功轉(zhuǎn)入棉花的原生質(zhì)體中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)棉花內(nèi)源靶基因GGB的定點(diǎn)編輯。王怡婷等[12]以大豆YT9啟動(dòng)子構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯體系能夠靶向敲除GmPDS11和GmPDS18雙基因，實(shí)現(xiàn)大豆靶向基因編輯功能。Pompili等[13]利用擬南芥U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)蘋(píng)果中火疫病相關(guān)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，以植株接種病菌后的發(fā)病情況來(lái)判斷基因編輯的效果，統(tǒng)計(jì)了蘋(píng)果的轉(zhuǎn)基因和基因組編輯效率。

近年來(lái)，越來(lái)越多的金銀花功能基因被相繼克隆出來(lái)，為金銀花的基因編輯奠定了基礎(chǔ)。喬永剛等[14]從金銀花中篩選出34個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子，DREB和RAV均能響應(yīng)低溫脅迫，隨著處理時(shí)間和組織部位的不同，表達(dá)量也存在差異，在一定程度上闡明金銀花AP2轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)低溫脅迫的機(jī)制。Yan等[15]發(fā)現(xiàn)在不同濃度的鹽脅迫下，HQT和PAL家族基因轉(zhuǎn)錄水平升高，綠原酸含量升高，藥材生物量積累和質(zhì)量都得到提高。Qi等[16]采用BLAST法和HMM法從忍冬轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中得到CYP450基因，通過(guò)qRT-PCR篩選出5個(gè)與綠原酸生物合成相關(guān)的CYP450s酶進(jìn)行探究，克隆得到3個(gè)LjC4Hs基因和2個(gè)LjC3Hs基因，有效地促進(jìn)了綠原酸的生物合成。目前為止U6啟動(dòng)子已應(yīng)用于多種植物，但是關(guān)于金銀花U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。金銀花基因組中含有多種U6啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子的活性也并不相同，并且U6啟動(dòng)子具有物種偏好性，外源的啟動(dòng)子在金銀花中可能難以高效啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，因此有必要克隆金銀花自身的U6啟動(dòng)子，以便于開(kāi)展金銀花的基因編輯。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的金銀花華金6號(hào)和煙草均由山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源研究室種植；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；基因組DNA提取試劑盒、純化試劑盒和5minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；啟動(dòng)子測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成；DNA聚合酶采用北京聚合美生物科技有限公司生產(chǎn)的新型藍(lán)色染料高保真Taq酶mix；染色液5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷X-Gluc和10×PBS緩沖液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子的克隆

取山東中醫(yī)藥大學(xué)藥圃中生長(zhǎng)良好的華金6號(hào)金銀花葉片，采用植物基因組提取試劑盒提取金銀花基因組DNA。利用設(shè)計(jì)好的引物(表1)和DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?8 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)體系為：DNA模板2.5 μL、正向引物和反向引物各1.25 μL、DNA聚合酶25 μL、水20 μL，共50 μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，膠回收試劑盒回收并純化目的片段?；厥胀瓿珊笈cpCE2 TA/Blunt-Zero載體連接、轉(zhuǎn)化、一次活化，對(duì)重組質(zhì)粒采用PCR方法鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，序列對(duì)比正確后進(jìn)行二次活化。

表1 本研究使用的引物序列

1.2.2 U6啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建

圖1 金銀花不同截短U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的融合表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.3 原生質(zhì)體的制備

取無(wú)菌煙草葉片1 g，剪成約0.5 cm2的碎片，加入10 mL酶解液(纖維素酶1%，離析酶0.5%，甘露醇0.6 mol/L，MES 20 mmol/L，KCl 20 mmol/L，55 ℃水浴10 min后加入BSA 0.1%和CaCl21 mmol/L)，26 ℃，60 r/min，避光酶解4 h[17]。酶解后的葉片過(guò)70 um細(xì)胞濾網(wǎng)，700 r/min離心5 min，棄上清后用W5(NaCl 154 mmol/L，CaCl2125 mmol/L，KCl 5 mmol/L)洗滌3次，加入1 mL MMM緩沖液(MgCl215 mmol/L，MES 0.1%，甘露醇 0.5 mmol/L)，于4 ℃保存。煙草原生質(zhì)體在4 ℃中保存的時(shí)間約為3 d[18]。

1.2.4 農(nóng)桿菌侵染原生質(zhì)體

取1 mL二次活化后的菌液，4 000 r/min離心5 min，棄上清；加入1 mL LB液體培養(yǎng)基懸浮菌體，靜置2 min后離心，棄上清；加入1 mL MS液體培養(yǎng)基，懸浮菌體，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)1～2 h；加入1 mL原生質(zhì)體，25 ℃培養(yǎng)30 min，離心，棄上清，加入1 mL MS液體培養(yǎng)基懸浮后，28 ℃放置24 h。

1.2.5 原生質(zhì)體染色和計(jì)數(shù)

在原生質(zhì)體中加入1 mL的染色液(X-Gluc母液100 mL+50 mmol/L的PBS 900 mL；X-Gluc母液：5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷 X-Gluc用N-N-二甲基甲酰胺配成20 mmol/L)，37 ℃染色12 h。12 h后使用75%乙醇脫色3次，滴入血球計(jì)數(shù)板，鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子克隆

從華金6號(hào)金銀花中分別克隆出Chr01 U6-F1、Chr02 U61-F1、Chr02 U61-F2、Chr02 U62-F1和Chr02 U62-F2啟動(dòng)子片段，回收純化后與T載體連接，PCR擴(kuò)增后根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)，將正確的質(zhì)粒送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期。

注：M—D2000; 1—Chr01 U6-F1;2—Chr02 U61-F1;3—Chr02 U61-F2;4—Chr02 U62-F1;5—Chr02 U62-F2。

2.2 啟動(dòng)子序列分析

本研究克隆了金銀花中3個(gè)候選的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其都含有RNA聚合酶Ⅲ結(jié)合、識(shí)別所需要的TATA框和USE元件(圖3)，這表明克隆的3個(gè)金銀花U6啟動(dòng)子可能都具有轉(zhuǎn)錄活性。

注：箭頭為U6RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

利用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切構(gòu)建好的T載體(圖4)，經(jīng)驗(yàn)證每個(gè)啟動(dòng)子片段大小正確，回收、純化目的片段并成功與PBI 121載體大片段相連(圖5)。

注：M—D2000。

注：M—D2000;1—Chr01 U6-F1;2—Chr02 U61-F1;3—Chr02 U61-F2;4—Chr02 U62-F1;5—Chr02 U62-F2。

2.4 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析

農(nóng)桿菌侵染原生質(zhì)體后，利用染色液對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行染色。本研究以CaMV35S啟動(dòng)子為陽(yáng)性對(duì)照，以農(nóng)桿菌為陰性對(duì)照，通過(guò)染色的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)Chr01 U6-F1啟動(dòng)子具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，Chr02 U62-F1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性低于Chr01 U6-F1啟動(dòng)子，Chr02 U61-F1、Chr02 U61-F2和Chr02 U62-F2啟動(dòng)子染色結(jié)果均未出現(xiàn)藍(lán)色，表明這些啟動(dòng)子不具備轉(zhuǎn)錄活性或轉(zhuǎn)錄活性極低(圖6)。

注:A—煙草原生質(zhì)體;B—Chr01 U6-F1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后的原生質(zhì)體染色;C—Chr02 U61-F1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后的原生質(zhì)體染色;D—Chr02 U61-F2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后的原生質(zhì)體染色; E—Chr02 U62-F1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后的原生質(zhì)體染色;F—Chr02 U62-F2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后的原生質(zhì)體染色;G—CaMV35S轉(zhuǎn)錄后的原生質(zhì)體染色;H—農(nóng)桿菌侵染后的原生質(zhì)體染色。

3 小結(jié)與討論

本研究從金銀花全基因組測(cè)序結(jié)果中篩選出多個(gè)候選的U6啟動(dòng)子，利用BLAST和PCR驗(yàn)證，最終確立Chr01 U6-F1、Chr02 U61-F1、Chr02 U61-F2、Chr02 U62-F1和Chr02 U62-F2這5種U6啟動(dòng)子進(jìn)行后續(xù)研究。通過(guò)構(gòu)建不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的植物融合表達(dá)載體和農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化等方法，最終篩選出Chr01 U6-F1這一長(zhǎng)度為255 bp的高效轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。在篩選出的啟動(dòng)子中Chr02 U62-F1的轉(zhuǎn)錄活性低于Chr01 U6-F1,其余啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較低或不具有轉(zhuǎn)錄活性。針對(duì)Chr02 U62-F1和Chr02 U62-F2這兩個(gè)同一啟動(dòng)子5′端不同截短染色情況差異提出假設(shè)，猜測(cè)其5′端有抑制因子或隨著序列長(zhǎng)度增加，組織轉(zhuǎn)染難度也相應(yīng)提高。研究表明，U6啟動(dòng)子在具備必要元件時(shí)即可擁有轉(zhuǎn)錄活性，而序列過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)存在抑制因子，使較長(zhǎng)序列的U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制[19]。卞書(shū)迅等[20]在包含必要的USE和TATA盒前提下，把蘋(píng)果10號(hào)染色體上的U6啟動(dòng)子從5′端進(jìn)行不同長(zhǎng)度的截短，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度為275 bp的U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最高，而長(zhǎng)度為1 527 bp和959 bp的U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較低。卞書(shū)迅提出蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的5′末端存在一些抑制因子，抑制了這些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。雷建峰等[21]從棉花中克隆得長(zhǎng)度分別為1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp的5種GbU6啟動(dòng)子，經(jīng)過(guò)篩選，最終確定了轉(zhuǎn)錄活性較高，序列長(zhǎng)度為1 134 bp的GbU6-5P，為構(gòu)建棉花CRISPR/Cas9基因組編輯載體系統(tǒng)提供了有效的啟動(dòng)子。在番茄中，U6啟動(dòng)子被截取到200 bp左右時(shí)仍具有較高的轉(zhuǎn)錄活性[22]，而在擬南芥中，U6啟動(dòng)子被截取到79 bp時(shí)還可用于基因編輯體系[23]。這些研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了啟動(dòng)子5′端有抑制因子或隨著序列長(zhǎng)度增加組織轉(zhuǎn)染難度也相應(yīng)提高的猜想。

綜上所述，本研究克隆并鑒定得到了一個(gè)具有高效轉(zhuǎn)錄活性的U6啟動(dòng)子，為在金銀花中建立CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)提供了理論依據(jù)，為后續(xù)對(duì)金銀花功能基因研究、種質(zhì)改良、新品種培育、提高抵抗生物及非生物脅迫能力奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。