熊艷杰，宋旭東，白 云，董麗儒，王瀟飛，李 雙，唐 慧，羅 丹，孫 紅

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北唐山 063000；2.華北理工大學(xué)生命科學(xué)院，河北唐山 063021；3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063210)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,死亡率一直高居?jì)D科惡性腫瘤之首，而血管在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了極其重要的作用。有研究表明在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的基因Fam38A，現(xiàn)在被稱為Piezo1，它編碼了哺乳動(dòng)物MS-cation通道[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、定位，能驅(qū)使胚胎新生血管形成[2]，其在皮膚、肺、膀胱、腸道和血管腔內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較多，而在結(jié)腸、胃和腎臟中表達(dá)較少[3-4]，在卵巢癌的表達(dá)鮮有報(bào)道。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在腫瘤疾病研究中被指出是一個(gè)不利因素，也是組織內(nèi)新微小血管形成和分布的主要調(diào)節(jié)因素[5]，對(duì)于促進(jìn)腫瘤血管的生成起關(guān)鍵作用。微血管密度(microvessel density，MVD)和微血管面積(microvascular area,MVA)與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)，是準(zhǔn)確衡量血管新生情況的重要參數(shù)。腫瘤細(xì)胞的不斷增殖和腫瘤體積的增加，都依賴于新微小血管在癌組織內(nèi)的錯(cuò)綜復(fù)雜的分布(如卵巢癌、結(jié)直腸癌等)。本研究將使用免疫組織化學(xué)方法研究Piezo1和VEGF共同在微血管的表達(dá)情況及相關(guān)性，分析其表達(dá)水平與MVD、MVA計(jì)數(shù)的相關(guān)性及臨床意義，從而發(fā)現(xiàn)兩者在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的重要作用，探討Piezo1是否能作為卵巢癌治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011—2020年華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院具有完整臨床及病理資料的卵巢腫瘤病變患者手術(shù)切除標(biāo)本，其中惡性卵巢上皮性腫瘤組織標(biāo)本50例，依據(jù)宮頸癌國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分期，Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期35例，Ⅳ期5例。交界性卵巢上皮性腫瘤組織15例，良性卵巢上皮性腫瘤組織標(biāo)本20例，正常卵巢組織15例。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1試劑與儀器

脫水機(jī)(Exalaim-8S)和染片機(jī)(Varistain Genini)購(gòu)自英國(guó)Shandon公司，包埋機(jī)(Histocentre 3)、切片機(jī)(RM2235)均購(gòu)自德國(guó)萊卡公司。兔多抗Piezo1抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，鼠抗人VEGF單克隆抗體、CD34抗體、PV6000通用試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色

病理標(biāo)本術(shù)后經(jīng)中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋后進(jìn)行3 μm切片，行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。VEGF、CD34和Piezo1(濃縮液1∶200稀釋使用)均采用免疫組織化學(xué)二步法(EnVision法)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

(1)Piezo1均以出現(xiàn)棕黃色顆粒著色判定為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性結(jié)果判讀分兩步，①按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；②按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率<5%為1分，5%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩者分值相乘≥3分為免疫組織化學(xué)陽(yáng)性，分4個(gè)等級(jí):0～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。(2)MVD和MVA的計(jì)算方法：以CD34標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，參照于飛等[7]校對(duì)計(jì)數(shù)方法，以5個(gè)高倍鏡視野微血管數(shù)平均值作為MVD值(個(gè)/HP)，應(yīng)用Image Pro Plus6圖像分析軟件計(jì)算MVA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 上皮性卵巢組織中Piezo1和VEGF蛋白的表達(dá)及MVD和MVA的情況

Piezo1主要定位于卵巢腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，血管內(nèi)皮細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)，部分間質(zhì)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)；VEGF也在血管內(nèi)皮細(xì)胞及卵巢腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；CD34標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，見圖1。4種卵巢組織Piezo1和VEGF表達(dá)陽(yáng)性率及MVD和MVA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且上皮性卵巢癌Piezo1和VEGF陽(yáng)性表達(dá)率及MVD和MVA最高，見表1。

2.2 Piezo1、VEGF、MVD和MVA與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

不同F(xiàn)IGO分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Piezo1、VEGF、MVD和MVA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；FIGO分期高和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Piezo1和VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)，見表2。

2.3 不同Piezo1、VEGF表達(dá)情況的MVD和MVA及其相關(guān)性

上皮性卵巢癌組織Piezo1、VEGF表達(dá)陽(yáng)性者M(jìn)VD和MVA水平高于表達(dá)陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在上皮性惡性卵巢腫瘤組織中，Piezo1和VEGF蛋白情況總體趨勢(shì)有一致性，但并不明顯(r=0.070，P=0.963)。MVD、MVA與Piezo1蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.160、P=0.266，r=0.154、P=0.286)；MVD與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.437、P=0.010)；MVD與MVA呈正相關(guān)(r=0.351、P=0.012)。

A：上皮性卵巢癌HE染色(×400)；B：上皮性卵巢癌中Piezo1的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)；C：上皮性卵巢癌中VEGF的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)；D：上皮性卵巢癌中CD34的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)。

圖1 上皮性卵巢癌中Piezo1、VEGF和CD34的病理結(jié)果

表2 Piezo1、VEGF、MVD和MVA的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2 Piezo1、VEGF、MVD和MVA的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 不同Piezo1、VEGF表達(dá)情況的MVD和MVA比較

3 討 論

2018年，全世界卵巢癌病例約295 000例[8]，其早期發(fā)現(xiàn)由于缺乏癥狀而困難重重，這導(dǎo)致生存率低(<30%)或進(jìn)展為腹膜轉(zhuǎn)移[9]，目前迫切需要新的治療靶點(diǎn)來(lái)提高這類患者的生存率。

Piezo1是一種非選擇性機(jī)械敏感性離子通道，它可以在淋巴管、心臟等心血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中[10]，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚敲除Piezo1后，上皮細(xì)胞遷移受到阻礙，細(xì)胞壞死，導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)形成并破壞了上皮穩(wěn)態(tài)性[11]。還有研究表明機(jī)械敏感的Piezo通道在病理生理學(xué)中的重要性，Piezo1和Piezo2在許多上皮來(lái)源的惡性腫瘤組織中均過(guò)表達(dá)，它們有作為腫瘤生物標(biāo)志物用于診斷和預(yù)后的潛力，可以作為治療策略的藥理和遺傳靶標(biāo)[12]。此外，Piezo1在人胃上皮細(xì)胞中具有致癌作用，與非腫瘤胃組織比較，在大多數(shù)被分析的胃癌細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤標(biāo)本中過(guò)度表達(dá)，是促進(jìn)胃癌進(jìn)展細(xì)胞增殖、遷移和侵襲所必需的因素[13]。在人類前列腺腫瘤標(biāo)本中，與非惡性組織比較，無(wú)論在mRNA水平還是蛋白水平上，Piezo1的表達(dá)均明顯升高，在人類骨肉瘤細(xì)胞、肝癌和膀胱癌中，Piezo1均過(guò)表達(dá)[14-16]。本研究Piezo1蛋白水平在卵巢癌組織中過(guò)表達(dá)，陽(yáng)性率明顯高于交界性腫瘤、良性病變組織和正常組織，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致。且在上皮性卵巢癌中，Piezo1的表達(dá)與腫瘤的分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Piezo1表達(dá)陽(yáng)性率越高，提示其可能與卵巢癌的預(yù)后相關(guān)，是上皮性卵巢癌預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)，且參與了上皮性卵巢癌的侵襲及轉(zhuǎn)移，這與ETEM等[17]報(bào)道相一致。對(duì)小鼠膀胱癌細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析顯示，Piezo1上調(diào)與腫瘤的分期直接相關(guān)。但其與患者年齡、腫瘤的大小、組織學(xué)類型、病理分級(jí)及浸潤(rùn)程度沒(méi)有明顯相關(guān)性，表明Piezo1在腫瘤發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。國(guó)內(nèi)外沒(méi)有Piezo1與女性生殖道腫瘤的相關(guān)報(bào)道，本研究填補(bǔ)了其在卵巢癌中研究的空白，因此，Piezo1可能是卵巢癌一種新的治療靶點(diǎn)。

VEGF是許多惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)，它是卵巢癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用最強(qiáng)的、特異性高的關(guān)鍵調(diào)控因子。與VEGF受體結(jié)合后，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、活化、存活、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供營(yíng)養(yǎng)條件[18]。調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)蛋白VEGF的表達(dá)水平可以影響腫瘤血管生成，并進(jìn)一步減少腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。本研究中，VEGF蛋白在上皮性卵巢癌中過(guò)表達(dá)，Piezo1和VEGF蛋白表達(dá)總體趨勢(shì)一致,都在腫瘤血管細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。本研究中Piezo1和VEGF不僅在卵巢腫瘤組織中表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)，其在卵巢腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)的MVD和MVA明顯高于陰性表達(dá),提示卵巢惡性腫瘤組織中新生微血管增多，Piezo1和VEGF與腫瘤的血管生成密切相關(guān)。且在腫瘤臨床分期高、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者，MVA也增高，與Piezo1和VEGF的表達(dá)有一致性，VEGF的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)。

綜上所述，Piezo1和VEGF有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，隨著卵巢組織惡性程度的進(jìn)展，Piezo1和VEGF表達(dá)水平都增加。Piezo1和VEGF可以作為衡量上皮性卵巢腫瘤的良惡性標(biāo)志，判斷腫瘤預(yù)后的重要參考指標(biāo)，可以作為潛在的上皮性卵巢癌的治療靶點(diǎn)。然而，Piezo通道在癌癥標(biāo)志中的作用有些令人困惑。就筆者所知，作為癌基因或癌抑制因子，Piezo1的活性可能取決于癌癥的具體類型，并可能涉及多種信號(hào)通路，需要進(jìn)一步探討和研究集中于開發(fā)更具選擇性的藥物和創(chuàng)新策略，以靶向Piezo1通道治療癌癥。