楊 帆，劉春娜

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DNP)是引起慢性腎衰竭的主要病因之一，也是造成接近30%糖尿病患者最終死亡的原因。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)已有1.298億的糖尿病患者，如何防治糖尿病并發(fā)癥，特別是DNP的發(fā)生、發(fā)展已成為首要任務(wù)[1]。DNP是由于高糖代謝紊亂引起的慢性腎損害，其病理改變表現(xiàn)為腎小球細(xì)胞的肥大，腎基底膜增厚及系膜擴(kuò)張，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。其中，腎間質(zhì)纖維化(kidney interstitial fibrosis，KIF)是引起腎臟疾病進(jìn)入慢性腎衰竭的最終途徑。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)可通過(guò)刺激單核、巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而使多種炎性因子表達(dá)上調(diào)，并促使纖維連接蛋白和膠原的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)也造成腎臟固有細(xì)胞肥大，最終誘導(dǎo)腎小球硬化和KIF的發(fā)生。近年的研究發(fā)現(xiàn)，多種炎性細(xì)胞因子、炎性酶等促進(jìn)腎臟組織增殖肥厚、纖維化，參與DNP的進(jìn)展[2]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥三七葉的提取物——三七葉苷(PPD-25-OH)，可能對(duì)DNP有預(yù)防和治療作用。PPD-25-OH具有多重藥理作用，如抗氧化應(yīng)激、抗炎鎮(zhèn)痛、降血脂和對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用，但其對(duì)DNP的作用和相關(guān)機(jī)制方面的研究較少。PPD-25-OH是否通過(guò)降低上述炎性趨化因子表達(dá)，在DNP中發(fā)揮保護(hù)作用仍不清楚[3-4]。因此，本研究采用DNP大鼠模型，給予受試藥物PPD-25-OH，旨在深入探討其對(duì)DNP的保護(hù)作用及可能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠，體重200～220 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK：2014-0010。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品

PPD-25-OH提取物通過(guò)高效液相法自行提取，提取純度>98%的單體化合物，分子結(jié)構(gòu)為：20(S)-25-OCH3-PPD。測(cè)定SDF-1、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BOSTER生物制劑有限公司；單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemotactic factor，MCP-1)試劑盒及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥

取SD大鼠，鏈脲佐菌素(45 mg/kg)腹腔注射，3 d后測(cè)定血糖>16.7 mmol/L定義為糖尿病模型，每日給予高糖、高脂飲食，共12周，誘導(dǎo)DNP模型的建立。取上述造模成功的40只DNP大鼠，每組10只，分為DNP組(生理鹽水)、PPD-25-OH低劑量組(PPD-L組，10 mg/kg PPD-25-OH)、PPD-25-OH中劑量組(PPD-M組，30 mg/kg PPD-25-OH)及PPD-25-OH高劑量組(PPD-H組，50 mg/kg PPD-25-OH)，另取10只SD大鼠作為空白陰性對(duì)照組(NG組，生理鹽水)，灌胃給藥4周。

1.2.2血生化指標(biāo)及腎功能的測(cè)定

在給藥4周后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用20%烏拉坦(1 g/kg)麻醉，行頸動(dòng)脈插管術(shù)并取血2 mL，3 000 r/min離心10 min，離心后取上清液，測(cè)定血肌酐和尿素氮水平，并用代謝籠收集24 h尿液測(cè)定尿蛋白，一方面證明DNP造模成功，另一方面測(cè)定PPD-25-OH對(duì)糖尿病腎功能改變。

1.2.3測(cè)定腎臟指數(shù)和病理改變

取血后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均剖取右腎，用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后稱(chēng)重，計(jì)算腎臟指數(shù)=腎質(zhì)量(mg)/體重(g)，用腎臟指數(shù)作為反映腎臟肥厚的量化指標(biāo)，并間接反映腎纖維化的程度。以4%多聚甲醛溶液固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，石蠟包埋，制成4 μm切塊備用，進(jìn)行病理檢測(cè)。

1.2.4腎組織炎性因子的測(cè)定

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死各組大鼠，迅速剖取左腎，用冰生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛溶液固定，PBS沖洗，—70 ℃凍存?zhèn)溆?。取一部分腎組織采用ELISA法測(cè)定SDF-1、COX-2，用酶標(biāo)儀于530 nm處測(cè)定吸光度(A)值，測(cè)定結(jié)果以nmol/mg 蛋白表示。另采用Western blot，檢測(cè)腎組織MCP-1及CTGF蛋白表達(dá)，作為反映腎臟纖維化的指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PPD-25-OH對(duì)DNP大鼠腎功能及腎臟指數(shù)的影響

DNP大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿的糖尿病典型癥狀，逐漸消瘦并體重降低，證明DNP造模成功。DNP組血肌酐、尿素氮、尿蛋白和腎臟指數(shù)水平明顯升高，與NG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DNP組比較，PPD-L、M、H組血肌酐、尿素氮、尿蛋白和腎臟指數(shù)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 PPD-25-OH對(duì)DNP大鼠腎臟病理改變的影響

病理結(jié)果中發(fā)現(xiàn)DNP大鼠腎組織均出現(xiàn)明顯病理改變，即腎小球變形，腎間質(zhì)纖維增生，腎小球及腎間質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，證明DNP造模成功。PPD-25-OH干預(yù)后，可以抑制DNP模型大鼠腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多及腎間質(zhì)纖維增生，腎小球變形不嚴(yán)重，并能減輕腎小球炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且PPD-L、M、H組與DNP組比較，損傷明顯減輕，見(jiàn)圖1。

表1 PPD-25-OH對(duì)DNP大鼠腎功能及腎臟指數(shù)的影響

A：NG組；B：DNP組；C：PPD-L組；D：PPD-M組；E：PPD-H組。

2.3 PPD-25-OH對(duì)DNP大鼠腎組織炎性因子的改變

DNP組SDF-1、COX-2水平升高，與NG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DNP組比較，PPD-L、M、H組SDF-1與COX-2水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4 PPD-25-OH對(duì)DNP腎組織MCP-1及CTGF蛋白表達(dá)的影響

DNP組MCP-1和CTGF蛋白表達(dá)水平均明顯升高，與NG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DNP組比較，PPD-L、M、H組MCP-1和CTGF蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，與NG組比較；b：P<0.05，與DNP組比較。

A：PPD對(duì)DNP大鼠腎組織中MCP-1表達(dá)的影響；B：PPD對(duì)DNP大鼠腎組織中CTGF表達(dá)的影響；1：NG組；2：DNP組；3：PPD-L組；4：PPD-M組；5：PPD-H組；a：P<0.05，與NG組比較；b：P<0.05，與DNP組比較。

3 討 論

DNP的主要病理改變包括腎臟組織的肥厚、腎細(xì)胞的肥大。其中，腎組織的纖維化是DNP最主要的病理特征，因此，防治腎纖維化是預(yù)防及治療DNP及多種腎臟疾病的主要手段和措施[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)中，DNP大鼠均出現(xiàn)多飲、多尿、體重降低，血肌酐、尿素氮及腎臟指數(shù)明顯增高，而給予PPD-25-OH治療后，能明顯改善上述癥狀，并能降低血肌酐、尿素氮和腎臟指數(shù)，證明其對(duì)腎功能有改善作用。腎臟指數(shù)是反映腎臟增大、肥厚的重要指標(biāo)。DNP組腎臟指數(shù)增大表明已出現(xiàn)腎臟肥厚，這是由于腎臟膠原纖維增多，促進(jìn)腎臟增厚纖維化，腎臟硬度也隨之增加，腎臟功能出現(xiàn)異常[7-8]。PPD-25-OH可降低腎臟指數(shù)，提示其通過(guò)降低腎纖維化，對(duì)腎臟肥厚有抑制作用。病理結(jié)果也證實(shí)，PPD-25-OH干預(yù)后，腎組織病理改變減輕，且可抑制大鼠腎小球基底膜增厚，抑制腎間質(zhì)纖維增生。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了DNP大鼠造模成功，也提示PPD-25-OH能通過(guò)改善腎功能，減輕腎組織肥厚，對(duì)DNP有治療作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PPD-25-OH能降低腎組織中炎性因子SDF-1與COX-2蛋白水平。SDF-1對(duì)腎小球系膜細(xì)胞具有趨化作用，COX-2是生成炎性介質(zhì)前列腺素的重要酶，在DNP腎臟組織肥厚和纖維化的病理性重構(gòu)中，二者均發(fā)揮了趨化促進(jìn)作用[9-10]。MCP-1是單核巨噬細(xì)胞的特異性趨化因子，可由體內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)腎組織受到刺激，特別是炎癥刺激后，MCP-1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨腎纖維化加重而增高，MCP-1通過(guò)趨化單核巨噬細(xì)胞在腎小管間質(zhì)聚集，介導(dǎo)腎間質(zhì)炎癥及腎間質(zhì)纖維化，從而促進(jìn)DNP纖維化的發(fā)展[11]。另外，CTGF是促進(jìn)腎臟和多種器官發(fā)生纖維化的最主要細(xì)胞因子，其水平高低能直接反映纖維化的程度。CTGF的過(guò)度表達(dá)可激活其下游信號(hào)分子和激酶，促進(jìn)腎臟組織纖維化和肥厚，從而導(dǎo)致腎臟病理性重構(gòu)[12]，PPD-25-OH降低MCP-1和CTGF的表達(dá)，提示其通過(guò)抑制炎性纖維化因子，進(jìn)而抑制DNP的纖維化起到對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

綜上所述，PPD-25-OH可有效抑制DNP腎臟增殖肥厚，進(jìn)而改善腎功能，改善腎間質(zhì)纖維化，對(duì)DNP大鼠腎臟組織具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用與抑制炎性因子SDF-1與COX-2的水平、降低MCP-1與CTGF蛋白表達(dá)有關(guān)。