朱云蕾， 黃清梅， 黃桂連， 陳玉君

人類腸道存在復(fù)雜、多樣和動(dòng)態(tài)的微生物群落。腸道微生物群在抵抗腸道病原體定植、培養(yǎng)和促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)成熟以及宿主代謝方面發(fā)揮不可或缺的作用[1]。嬰兒腸道微生物群從出生起開始建立，容易受到多種圍產(chǎn)期因素的影響，包括分娩方式、喂養(yǎng)類型、胎齡和抗生素用藥等[2-3]。研究顯示，約25%的女性在懷孕期間接受過一個(gè)療程的抗生素治療，抗生素約占妊娠期所用處方藥物的80%[4]。目前，越來越多的研究認(rèn)為母親產(chǎn)前使用抗生素是影響新生兒腸道菌群建立的因素之一[5]。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)探討產(chǎn)前抗生素暴露對(duì)晚期早產(chǎn)兒腸道菌群的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2020年3月至2021年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院治療的晚期早產(chǎn)兒13例，胎齡340/7～366/7周。其中5例早產(chǎn)兒母親產(chǎn)前使用過抗生素(觀察組)，平均療程為(2.20±1.10)d，余8例早產(chǎn)兒母親產(chǎn)前未使用過抗生素(對(duì)照組)。早產(chǎn)兒出生后均為混合喂養(yǎng)，兩組在分娩方式、胎齡、性別、出生體重等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。研究獲早產(chǎn)兒父母或法定監(jiān)護(hù)人知情同意。

表1 兩組一般情況比較

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)34周≤胎齡<37周；(2)出生后即轉(zhuǎn)入新生兒科住院治療；(3)母親產(chǎn)前2周內(nèi)使用過β-內(nèi)酰胺類抗生素(五水頭孢唑林鈉)。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)出生后即轉(zhuǎn)入新生兒科住院治療；(2)母親產(chǎn)前2周內(nèi)未使用抗生素；(3)性別、胎齡、分娩方式、出生體重與觀察組相匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重復(fù)雜的先天性心臟病、唐氏綜合征、遺傳代謝病或重度窒息；(2)合并壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)、敗血癥、腹裂、胃腸道穿孔、消化道畸形需手術(shù)治療者；(3)糞便標(biāo)本收集期間早產(chǎn)兒接受抗生素及益生菌治療。

1.3標(biāo)本采集 采用無菌通便的方法，使用無菌糞便采集杯收集日齡為3(D3)、7(D7)、14(D14)天的嬰兒糞便標(biāo)本，-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)錂z。

1.4細(xì)菌DNA提取與測(cè)序 采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，美國(guó))提取糞便細(xì)菌基因組DNA，檢測(cè)DNA純度、濃度及完整性。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法擴(kuò)增16SrRNA的V3-V4區(qū)。應(yīng)用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5生物信息分析 對(duì)Illumina Miseq PE300平臺(tái)獲得的原始序列進(jìn)行質(zhì)控和拼接。應(yīng)用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OUT)聚類?；赗DP classifier貝葉斯算法進(jìn)行分類學(xué)分析，根據(jù)結(jié)果，分析各組腸道菌群的多樣性指數(shù)及物種組成。

1.6觀察指標(biāo) (1)采用Shannon指數(shù)進(jìn)行多樣性分析，其值越大，說明菌群多樣性越高。(2)通過分析腸道菌群在門、屬水平的相對(duì)豐度來描述其物種組成。

數(shù)(n)表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1測(cè)序結(jié)果 共收取39份糞便樣本，其中觀察組有1例D3日齡的糞便樣本PCR擴(kuò)增失敗。38份測(cè)序樣本經(jīng)處理后共得到1 081 366條優(yōu)化序列，所檢測(cè)到的腸道菌群隸屬于1域、1界、11門、20綱、35目、64科、132屬、217種、324 OUT。

2.2兩組D3、D7、D14日齡嬰兒Shannon指數(shù)比較

在D3、D7、D14，兩組Shannon指數(shù)隨嬰兒日齡的增長(zhǎng)而上升，觀察組Shannon指數(shù)始終低于對(duì)照組，但僅在D3時(shí)觀察組Shannon指數(shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.717，P=0.007)。見圖1。

2.3兩組腸道菌群門水平比較 隨著嬰兒日齡的增長(zhǎng)，對(duì)照組變形菌門占比降低而觀察組占比升高；對(duì)照組厚壁菌門占比升高而觀察組占比降低。在D3、D7、D14日齡，對(duì)照組擬桿菌門占比呈先降低后升高的趨勢(shì)，而觀察組呈逐漸升高的趨勢(shì)。兩組放線菌門占比均隨嬰兒日齡的增長(zhǎng)而升高。見圖2。

圖1 兩組D3、D7、D14日齡嬰兒Shannon指數(shù)比較圖

圖2 兩組腸道菌群門水平比較圖

2.4兩組腸道菌群屬水平比較 隨著嬰兒日齡的增長(zhǎng)，對(duì)照組腸球菌屬占比逐漸增加，觀察組腸球菌屬水平呈先增高再降低趨勢(shì)。對(duì)照組克雷伯桿菌屬占比先增加后降低，而觀察組克雷伯桿菌屬占比逐漸增加。觀察組副擬桿菌屬水平呈先增高再降低趨勢(shì)，而對(duì)照組幾乎檢測(cè)不到副擬桿菌屬。在D3時(shí)，與對(duì)照組比較，觀察組雙歧桿菌屬定植減少，厭氧芽胞桿菌屬、腸桿菌屬及克呂沃爾氏菌屬定植延遲。見圖3。

圖3 兩組腸道菌群屬水平比較圖

3 討論

3.1抗生素對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)具有重要意義，其在維護(hù)人類健康方面發(fā)揮了重要作用。然而，人們也越來越擔(dān)心使用抗生素所帶來的負(fù)面效果，包括對(duì)腸道菌群造成的損害。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，觀察組腸道菌群的多樣性和豐富度均顯著降低，在D3日齡時(shí)，對(duì)照組Shannon指數(shù)顯著高于觀察組，表明產(chǎn)前抗生素暴露可降低早產(chǎn)兒腸道菌群的多樣性，這與國(guó)外多項(xiàng)研究結(jié)果[6-8]相似。在本研究期間，觀察組Shannon指數(shù)始終低于對(duì)照組，但僅在D3差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與產(chǎn)前抗生素暴露對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群的影響減弱有關(guān)，早產(chǎn)兒腸道菌群在其他影響因素及自身調(diào)節(jié)下，菌群多樣性逐漸恢復(fù)。在門水平上，對(duì)照組變形菌門占比逐漸降低，厚壁菌門占比逐漸升高，而觀察組則成相反趨勢(shì)變化。在屬水平上，D3日齡時(shí)，觀察組菌屬多樣性單一，以腸球菌屬、埃希菌-志賀菌屬、葡萄球菌屬為主，部分腸道共生菌如雙歧桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、檸檬酸桿菌屬等定植延遲，表明產(chǎn)前使用抗生素可影響早產(chǎn)兒腸道菌群的正常定植，抑制腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)，使早產(chǎn)兒腸道部分有益菌如雙歧桿菌定植延遲，這與Zou等[9]的研究結(jié)果相似。Stearns等[7]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前抗生素暴露使雙歧桿菌定植延遲且相對(duì)豐度降低，這種影響可持續(xù)至產(chǎn)后6周，較本研究的恢復(fù)時(shí)間慢，這可能因該研究對(duì)象抗生素暴露時(shí)間及抗生素使用種類與本研究不同有關(guān)。

3.2多項(xiàng)研究表明，產(chǎn)前抗生素暴露的足月兒腸道變形菌門相對(duì)豐度增加，放線菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度減少,但厚壁菌門相對(duì)豐度變化存在爭(zhēng)議[7，10-11]。本研究觀察到抗生素暴露的早產(chǎn)兒變形菌門相對(duì)豐度日益上升，厚壁菌門相對(duì)豐度日益降低。變形菌門中有害菌屬多于有益菌屬，腸道中變形菌門的增多反映了腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定或生態(tài)失調(diào)[12]，由此推測(cè)，產(chǎn)前抗生素暴露可能與早產(chǎn)兒腸道菌群失調(diào)有關(guān)。另外，變形菌門豐度上升和厚壁菌門豐度降低也可能增加NEC的發(fā)生率[13]。副擬桿菌屬是一類革蘭陰性厭氧菌，是人體核心菌群之一，其對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類抗生素具有廣泛的耐藥性[14-15]。也有研究顯示產(chǎn)前抗生素暴露與新生兒抗生素耐藥增加有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，產(chǎn)前抗生素暴露使早產(chǎn)兒副擬桿菌屬豐度增加，提示臨床醫(yī)師需要關(guān)注孕期抗生素的使用與新生兒產(chǎn)生抗生素耐藥之間的關(guān)系。

3.3抗生素暴露可能對(duì)新生兒產(chǎn)生不良影響，如引起支氣管肺發(fā)育不良[16]、肥胖[17]、哮喘[18]、濕疹[19]和早發(fā)性敗血癥[20]等，提示臨床上需要權(quán)衡孕婦產(chǎn)前抗生素治療的利弊。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，給予早產(chǎn)兒補(bǔ)充益生菌能增加其腸道微生物的多樣性，促進(jìn)腸道有益菌的定植[21]，提示有可能通過補(bǔ)充益生菌制劑來改善產(chǎn)前抗生素暴露嬰兒腸道正常菌群的建立。但本研究也存在一些不足：(1)病例樣本偏少，觀察時(shí)間較短，未能觀察產(chǎn)前抗生素暴露對(duì)晚期早產(chǎn)兒腸道菌群的遠(yuǎn)期影響；(2)所有樣本均來源于母親產(chǎn)前預(yù)防性使用抗生素，抗生素使用時(shí)間較短，未能了解到更長(zhǎng)時(shí)間抗生素暴露對(duì)晚期早產(chǎn)兒腸道菌群的影響。這些問題有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，產(chǎn)前抗生素暴露可影響早產(chǎn)兒腸道菌群的建立，改變其多樣性和豐富度，使早產(chǎn)兒腸道菌群多樣性降低，腸道共生菌定植延遲，提示臨床醫(yī)師需謹(jǐn)慎考慮對(duì)孕婦予以抗生素治療，以防對(duì)新生兒產(chǎn)生不良影響。