李雪暉 羅心雨 王 瑩

(1. 南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061；2. 廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所，廣東 廣州 510650)

南瓜(Cucurbita moschata duch)是葫蘆科南瓜屬草本植物的果實，在中國各地被廣泛種植，富含各種維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種高營養(yǎng)、低脂的功能性食品，作為一種防治糖尿病的食品而備受關(guān)注[1-2]。南瓜多糖富含降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等功能[3-4]的生物活性成分，作為自由基清除劑在預(yù)防氧化損傷方面起著重要作用，其降血糖活性在動物試驗和臨床試驗中得以證實[5]。

分子修飾是通過物理、化學(xué)及生物學(xué)等手段對化合物進行結(jié)構(gòu)改造，以獲得眾多結(jié)構(gòu)類型衍生物的方法。選用硫酸化、磷酸化、烷基化、羧甲基化等方式[6-7]對多糖分子結(jié)構(gòu)進行適量修飾，能有效提高其生物學(xué)活性。通過向多糖的支鏈上導(dǎo)入羧甲基基團的羧甲基化修飾技術(shù)[8]在南瓜多糖修飾中使用較多，主要是由于其控制相對容易、生產(chǎn)成本低，且反應(yīng)產(chǎn)物無毒性。多糖可捕捉過氧化鏈式反應(yīng)中產(chǎn)生的活性氧，減少反應(yīng)鏈的長度，阻斷或減緩反應(yīng)的進行，起到清除自由基的作用，但對于羧甲基化南瓜多糖的抗氧化活性研究尚未見報道，且南瓜多糖的羧甲基化修飾結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系也尚不明確。

文章擬以南瓜多糖為原材料，對其進行羧甲基化修飾，用紫外分光光度法對羧甲基化南瓜多糖取代度進行研究，并探討羧甲基化南瓜多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除作用以及α-葡萄糖苷酶抑制活性的抑制作用，期望通過羧甲基化的方式提高南瓜多糖的抗氧化活性和降血糖活性，為南瓜多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟南瓜：市售；

一氯乙酸(MCA)、硫代巴比妥酸、鹽酸、濃硫酸、羥基乙酸(乙醇酸)、變色酸、維生素C、氫氧化鈉、鹽酸羥胺、無水乙醇、三氯化鐵、過氧化氫(30%)、葡萄糖、苯酚、木瓜蛋白酶等：國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計：WFZ UV-2000型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A型，上海恒科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HHS21-8型，上海博迅實業(yè)有限公司；

電子天平：JA2003型，上海市恒平科技科學(xué)儀器有限公司；

臺式離心機：DL-5A型，上海菲恰爾分析儀器有限公司；

高效液相色譜儀：G1362A型，美國安捷倫科技公司；

真空冷凍干燥機：FD-1D-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

酶標儀：Multiskan MK3型，美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 南瓜多糖、羧甲基化南瓜多糖的制備

(1)南瓜粉：根據(jù)文獻[9]。

(2)南瓜多糖(PP)：根據(jù)文獻[10]。

(3)羧甲基化南瓜多糖(CM-PP)：稱取0.200 0 g PP，加入一定量的3.0 mol/L NaOH溶液，滴加一氯乙酸，一定溫度下反應(yīng)一定時間，調(diào)節(jié)pH為7，過濾，透析，冷凍干燥得CM-PP。

1.3.2 PP含量和CM-PP取代度測定

(1)PP含量：采用苯酚—硫酸法[11-12]。

(2)CM-PP取代度：采用紫外分光光度法[13]。

1.3.3 單因素試驗

(1)一氯乙酸濃度：固定反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時間3.0 h，考察一氯乙酸濃度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mol/L)對羧甲基化多糖取代度的影響。

(2)反應(yīng)溫度：固定反應(yīng)時間3.0 h、一氯乙酸濃度1.5 mol/L，考察反應(yīng)溫度(40，50，60，70，80 ℃)對羧甲基化多糖取代度的影響。

(3)反應(yīng)時間：固定反應(yīng)溫度70 ℃、一氯乙酸濃度1.5 mol/L，考察反應(yīng)時間(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h)對羧甲基化多糖取代度的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以一氯乙酸濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間為自變量，以羧甲基化多糖取代度為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計基本原理優(yōu)化CM-PP制備工藝。

1.3.5 抗氧化活性試驗

(1)羥自由基清除率：分別取樣品溶液1 mL，依次加入1 mL FeSO4溶液(9 mmol/L)和水楊酸—乙醇溶液(9 mmol/L)，加入6 mL蒸餾水，搖勻。以等體積的蒸餾水代替樣品溶液作空白對照，以蒸餾水代替水楊酸為本底組。加入1 mL濃度為8.82 mmol/L 的H2O2溶液，37 ℃水浴1 h，測定510 nm處吸光度，按式(1)計算羥自由基清除率。

(1)

式中：

I——自由基清除率，%；

Ii——本底組吸光度；

Ij——樣品組吸光度；

I0——對照組吸光度。

(2)超氧陰離子自由基清除率：向試管中加入4.6 mL 濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)，25 ℃水浴20 min，分別加入1 mL樣品溶液，0.4 mL濃度為10 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，搖勻，25 ℃水浴4 min，加入0.1 mL濃度為8 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，測定325 nm處吸光度，以蒸餾水取代樣品溶液為對照組，以蒸餾水取代鄰苯三酚溶液為本底組，并按式(1)計算超氧陰離子自由基清除率。

1.3.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性試驗 根據(jù)文獻[14]略修改。向酶標板中加入80 μL磷酸緩沖液(pH 6.8)，加入16 μL樣液和α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)，37 ℃反應(yīng)15 min；加入16 μL濃度為2.5 mmol/L的p-NPG溶液，37 ℃反應(yīng)30 min；加入100 μL濃度為1.0 mol/L的Na2CO3溶液，用酶標儀測定λ=405 nm處吸光度，以阿卡波糖為陽性對照，按式(2)計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

(2)

式中：

α——α-葡萄糖苷酶抑制率，%；

αi——本底組吸光度；

αj——樣品組吸光度；

α0——對照組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2019b軟件處理數(shù)據(jù)，并制圖；使用Design-Expert 8.06軟件構(gòu)建響應(yīng)面模型，并進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CM-PP制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗 由圖1(a)可知，隨著一氯乙酸濃度的升高，羧甲基化多糖取代度呈先上升后下降的趨勢。當一氯乙酸濃度為1.5 mol/L時，羧甲基化多糖取代度最大，可能是隨著一氯乙酸用量的增加，促使NaOH滲透到多糖分子中產(chǎn)生鈉鹽，增加了與一氯乙酸化學(xué)反應(yīng)的機會，進而增加了羧甲基化多糖取代度；但一氯乙酸用量過多會加速一氯乙酸的水解，同時消耗部分NaOH，使反應(yīng)過程體系pH值下降，從而不利于取代反應(yīng)的進行，羧甲基化多糖取代度下降。因此，最佳一氯乙酸濃度為1.5 mol/L。

由圖1(b)可知，當反應(yīng)溫度為40～70 ℃時，羧甲基化多糖取代度隨反應(yīng)溫度的升高而增大，可能是溫度升高提高了化學(xué)反應(yīng)試劑的活力，加快了羧甲基化反應(yīng)；同時，升高溫度使原料迅速溶脹，顆粒中NaOH、一氯乙酸和分散劑的相互滲透能力增強，分子之間的有效接觸面積增多，因而取代度提高。當反應(yīng)溫度>70 ℃時，羧甲基化取代度隨反應(yīng)溫度的升高而減小，是因為溫度過高可能會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，從而引起焦糖化反應(yīng)，同時副反應(yīng)速率提高，會影響主反應(yīng)速率，使一氯乙酸利用率降低；另外，由于環(huán)境溫度過高、分子運動加速導(dǎo)致分子結(jié)合力下降，使化學(xué)反應(yīng)速率顯著下降，取代度降低。因此，最優(yōu)反應(yīng)溫度為70 ℃。

由圖1(c)可知，當反應(yīng)時間為2.0～3.0 h時，羧甲基化多糖取代度與反應(yīng)時間呈正相關(guān)關(guān)系，可能是反應(yīng)活性中心隨反應(yīng)時間的增加而增多，有利于多糖與一氯乙酸充分接觸，使得取代度逐漸增加。當反應(yīng)時間為3.0 h時，取代度達到最高，當反應(yīng)時間>3.0 h時，取代度與反應(yīng)時間呈負相關(guān)關(guān)系，可能是反應(yīng)過程中出現(xiàn)了副反應(yīng)，從而使取代度降低。因此，最優(yōu)的反應(yīng)時間為3.0 h。

圖1 各因素對羧甲基化多糖取代度的影響Figure 1 Effects of various factors on the degree of substitution of carboxymethylated polysaccharide

2.1.2 羧甲基化南瓜多糖工藝優(yōu)化 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以一氯乙酸濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間為試驗因素，以羧甲基化取代度為考察指標，并利用Design-Expert 8.06軟件構(gòu)建三因素三水平響應(yīng)面試驗。因素水平表見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計Table 1 Response surface test factors and horizontal design

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The Box-Behnken test scheme and results

運用Design-Expert 8.06軟件對試驗結(jié)果進行二次方程模型擬合，得二次回歸方程：

Y=1.18+0.17A+0.025B+0.037C+0.022AB-0.036AC+0.032BC-0.100A2-0.068B2-0.11C2。

(3)

由表3可知，模型F=21.32較高，顯著水平P=0.000 3 較低，因變量和全體不同自變量之間的線性函數(shù)關(guān)聯(lián)顯著。失擬項不顯著(P=0.100 3)，表明其他因素對取代度干擾較小，回歸模型與實際情況相符合。影響取代度大小的因素主次順序為一氯乙酸濃度>反應(yīng)時間>反應(yīng)溫度，但各因素之間的相互作用并不明顯(見圖2)。

圖2 各因素相互作用對羧甲基化取代度的影響Figure 2 Effect of interaction of various factors on degree of substitution of carboxymethylation

表3 響應(yīng)值方差分析?Table 3 Analysis of variance of response value

最佳工藝條件為一氯乙酸濃度1.93 mol/L、反應(yīng)溫度73.40 ℃、反應(yīng)時間3.04 h，該條件下的CM-PP取代度理論值為1.254。

2.1.3 模型驗證 為了檢驗?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性和可行性，將最佳制備工藝條件修正為：一氯乙酸濃度1.9 mol/L、反應(yīng)溫度73 ℃、反應(yīng)時間3 h。該工藝條件下的羧甲基化多糖取代度為1.247(n=4)，與理論值非常相近，證明了響應(yīng)面試驗法優(yōu)化羧甲基化南瓜多糖制備工藝是合理可行的。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 羥自由基清除能力 由表4可知，不同質(zhì)量濃度下，PP、CM-PP樣品均存在不同的羥自由基清除率，具有明顯的羥自由基清除能力；且PP、CM-PP的羥自由基清除率隨質(zhì)量濃度的提高呈劑量濃度依賴性關(guān)系[15]。從濃度角度考慮，維生素C、PP、CM-PP的IC50值分別為4.33×10-4，4.21×10-5，3.26×10-6mol/L，表明引入羧甲基基團能提高多糖對羥自由基的清除能力，且優(yōu)于維生素C，可能與修飾后的多糖結(jié)構(gòu)及羥基基團含量有關(guān)，與周際松等[16]的結(jié)果相似，可能是多糖鏈構(gòu)象結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了改變，從而提高了羥自由基的清除能力。

2.2.2 超氧陰離子自由基清除能力 由表4可知，PP、CM-PP對超氧陰離子自由基的清除率與質(zhì)量濃度有顯著的正相關(guān)關(guān)系[17-19]，與柳紅等[20]的研究結(jié)果一致。從濃度角度考慮，維生素C、PP、CM-PP的IC50值分別為5.14×10-4，1.54×10-5，3.06×10-6mol/L，說明CM-PP對超氧陰離子自由基的清除能力顯著提高，可能是在PP中引入了羧甲基基團，從而改變了多糖的生物學(xué)活性；并且其抗氧化活性高于維生素C。陳放[21]研究表明：苦瓜多糖經(jīng)羧甲基化修飾后其清除作用增強，可能與多糖水溶性有一定的關(guān)系，其作用機制可能是抑制超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫或羥自由基等活性氧。

表4 PP和CM-PP對自由基的清除率Table 4 Percentage scavenging of hydroxyl radical by PP and CM-PP (n=3)

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

由圖3可知，PP、CM-PP對α-葡萄糖苷酶的抑制率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系；但隨著質(zhì)量濃度的增加，其抑制作用變化變小，表明南瓜多糖及羧甲基化南瓜多糖均有一定的抑制糖吸收的功能，降糖效果明顯略低于阿卡波糖，但與阿卡波糖呈大致平行的抑制曲線，這與趙駿等[22]的研究結(jié)果一致。牛慶川等[23]研究發(fā)現(xiàn)，羧甲基化紅棗多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用明顯高于紅棗多糖，并闡明了降血糖相關(guān)的作用機理。同時，試驗發(fā)現(xiàn)南瓜多糖具有預(yù)防糖尿病、促進機體維持正常血糖的生理功能。因此，多糖可用于降血糖藥品、降血糖功能性藥品、天然保健食品等多種途徑[24]。查閱相關(guān)文獻[25]發(fā)現(xiàn)，南瓜多糖中引入了羧甲基基團，可能使其水溶性和電負性發(fā)生了改變或者增強，進而影響了抗氧化和降血糖等生物活性。

圖3 α-葡萄糖苷酶抑制率與多糖質(zhì)量濃度的關(guān)系Figure 3 Relationship of α-glycosidase inhibitory activity and polysacchrides concentration

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗法優(yōu)化了羧甲基化南瓜多糖的制備工藝。結(jié)果表明，羧甲基化南瓜多糖的最佳制備工藝為：一氯乙酸濃度1.9 mol/L、反應(yīng)溫度73 ℃、反應(yīng)時間3 h，該條件下的羧甲基化南瓜多糖取代度為1.247，說明羧甲基化南瓜多糖的優(yōu)化工藝是合理可行的。南瓜多糖和羧甲基化南瓜多糖均可以清除羥自由基和超氧陰離子自由基；與修飾前南瓜多糖相比，多糖的羧甲基化修飾也能提高其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，說明羧甲基化南瓜多糖具有較強的抗氧化活性和降血糖活性。后續(xù)可對羧甲基化南瓜多糖的降血糖作用機制進行分析。