王秋丹 趙凱迪 林長青

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，吉林 延吉 133000)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是一種胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木，在世界各地均有種植。研究[1]顯示，沙棘多糖具有一定的緩解體力疲勞、增強(qiáng)小鼠運(yùn)動能力和抗氧化的作用。

植物多糖是植物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚合度超過10個的聚糖。如今，植物多糖因其具有無毒、可生物降解、低成本、易獲得的特性，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品行業(yè)[2-3]。但目前對于沙棘多糖的報道多是集中在沙棘多糖的提取工藝以及純化研究[4-5]，在功能性方面報道過沙棘多糖抗疲勞、抗氧化、抗炎等[6-8]。

2型糖尿病(T2DM)，一種內(nèi)分泌代謝疾病，占糖尿病病例的大多數(shù)，已成為世界性的問題[9-10]。據(jù)報道[11]，2019年糖尿病病例數(shù)量達(dá)到4.63億例，預(yù)計2030年將增至約5.78億例，2045年將增至7.00億例。T2DM主要是由于體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗，使機(jī)體代謝失調(diào)從而引發(fā)糖尿病的發(fā)生，因此對于T2DM的治療可從胰島素抵抗方面著手。目前市售治療糖尿病的藥物多為西藥，如二甲雙胍，此類藥物依賴性強(qiáng)，且長期使用會有一定的副作用[12]。

沙棘富含多種營養(yǎng)活性成分，但目前對沙棘多糖改善胰島素抵抗方面的報道較少，且僅停留于動物層面的研究[13]。試驗(yàn)擬研究沙棘多糖對胰島素抵抗細(xì)胞模型的改善作用及可能機(jī)制，旨在為開發(fā)沙棘成為新型治療糖尿病產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘：延吉市海蘭江藥店；

鹽酸吡格列酮：江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2：上海ATCC細(xì)胞庫；

2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(CCK-8)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；

重組人胰島素、DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、胰酶、糖原試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

胎牛血清：美國Gibco公司；

葡萄糖試劑盒、一氧化氮合成酶(NOS)測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

離心機(jī)：TDZ5-WS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

熒光倒置顯微鏡：Olympus IX73型，奧林巴斯(中國)有限公司；

細(xì)胞培養(yǎng)箱：MCO-5AC型，日本SANYO有限公司；

酶標(biāo)儀：BK-EL10C型，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；

電泳儀：Western Blot型，BIO-RAD Laboratories Inc.；

凝膠成像系統(tǒng)：BioSpectrum510型，美國UVP公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘多糖的提取 參考祝敏等[14]的方法并稍作改動，將沙棘烘干粉碎，過40目篩，超聲波功率300 W，料液比(m沙棘粉∶V水)為1∶30 (g/mL)，提取時間1 h，提取溫度80 ℃浸提兩次，合并兩次提取液，用80%乙醇醇沉24 h，Sevage法除蛋白，1%活性炭脫色，冷凍干燥24 h，凍干成粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 沙棘多糖含量的測定 采用苯酚硫酸法[15]。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮中凍存的細(xì)胞，快速解凍后加入預(yù)先已添加10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的15 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接于培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、0.5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%～90%且生長狀態(tài)良好時，使用0.25%的胰酶消化傳代，并計數(shù)。

1.2.4 沙棘多糖對HepG2細(xì)胞活力的影響 采用CCK-8法。取對數(shù)期HepG2細(xì)胞，將其稀釋成5×104個/mL單細(xì)胞懸液，并接種于96孔板中，每孔200 μL。分別配制質(zhì)量濃度為50，100，200，400，800，1 600 μg/mL的沙棘多糖，對HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h，每孔加入10 μL CCK-8，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值，計算各組細(xì)胞活力以篩選出沙棘多糖安全劑量。

1.2.5 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立與分組 取生長狀態(tài)良好，細(xì)胞貼壁生長達(dá)90%的HepG2細(xì)胞，稀釋成5×104個/mL單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種至96孔板中。細(xì)胞共分為5組，分別為正常組、模型組、沙棘多糖低劑量組(200 μg/mL)、沙棘多糖高劑量組(400 μg/mL)、陽性組(鹽酸吡格列酮200 μg/mL)。除正常組外，其余各組用含5×10-8mol/L胰島素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h[16]。

1.2.6 葡萄糖消耗量測定 取培養(yǎng)基上清，用葡萄糖試劑盒檢測培養(yǎng)基上清中葡萄糖含量，具體操作按說明書進(jìn)行，并按式(1)計算葡萄糖消耗量。

ΔG=G0-Gx，

(1)

式中：

ΔG——各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量，mmol/L；

G0——未接種細(xì)胞的空白組中葡萄糖含量，mmol/L；

Gx——測得各組培養(yǎng)液中葡萄糖含量，mmol/L。

1.2.7 糖原相對含量測定 收集5×106～10×106個細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，加入0.75 mL提取液超聲波破碎細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至10 mL 試管中，置于沸水浴中煮沸20 min，冷卻后，用蒸餾水定容到5 mL，混勻，8 000×g、25 ℃離心10 min，取上清液待測，按糖原試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.8 SOD、MDA測定 收集細(xì)胞上清液用于SOD檢測，分別消化收集細(xì)胞用于MDA檢測。按SOD、MDA、ROS、SOD試劑盒說明書操作，測定各指標(biāo)，并計算結(jié)果。

1.2.9 相關(guān)蛋白測定 Western Blot法。用RIPA強(qiáng)裂解液進(jìn)行細(xì)胞蛋白的提取，12 000×g離心10 min，取上清并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，5×蛋白上樣緩沖液進(jìn)行煮沸，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)目標(biāo)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，電壓100 V，電泳時間120 min，電泳結(jié)束后以100 V，60 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，之后于5%的脫脂奶粉中封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影并拍照。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 23.0對整理后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算各組均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行顯著性差異分析。所得的數(shù)據(jù)以圖表和均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。P<0.05表示有顯著性差異，P>0.05表示無顯著性差異即無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘多糖含量

多糖得率為9.15%，圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=10.075x+0.009 4(R2=0.996 4)。由此算出沙棘多糖含量為88.46%。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of polysaccharides

2.2 沙棘多糖對HepG2細(xì)胞活力的影響

根據(jù)細(xì)胞活力篩選出后續(xù)使用的安全劑量。圖2為不同質(zhì)量濃度沙棘多糖對HepG2細(xì)胞干預(yù)24 h后的細(xì)胞活力情況。由圖2可知，在沙棘多糖質(zhì)量濃度為50～400 μg/mL時，細(xì)胞活力均在80%以上，在沙棘多糖質(zhì)量濃度達(dá)到800 μg/mL時，細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇的最大安全質(zhì)量濃度為400 μg/mL?？梢?，當(dāng)濃度超過一定范圍后，沙棘多糖對細(xì)胞活力會出現(xiàn)顯著性影響。

字母不同代表差異顯著(P<0.05)圖2 沙棘多糖質(zhì)量濃度對HepG2細(xì)胞活力的影響Figure 2 The effect of different concentrations of seabuckthorn polysaccharides on the viability of HepG2 cells

2.3 沙棘多糖對葡萄糖消耗量的影響

在正常機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞利用胰島素將葡萄糖吸收并分解，以便為機(jī)體提供能量，當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗時，由于細(xì)胞對胰島素的敏感度降低，不能有效識別胰島素傳遞的信號，導(dǎo)致細(xì)胞對血液內(nèi)的葡萄糖攝取率下降，因此葡萄糖的消耗減少，而血液內(nèi)的葡萄糖則增多[17]。加入能夠改善胰島素抵抗的藥物后，細(xì)胞對葡萄糖的消耗量有所增多。由圖3可知，與正常組相比，模型組葡萄糖消耗量顯著降低(P<0.05)，經(jīng)沙棘多糖高劑量組處理后能夠顯著提高其葡萄糖消耗量(P<0.05)，且與陽性組間無顯著性差異(P>0.05)?？赡苁怯捎谏臣嗵钦{(diào)節(jié)了細(xì)胞識別胰島素的敏感程度，從而提高了細(xì)胞對葡萄糖的吸收。因此推測，沙棘多糖能夠調(diào)節(jié)胰島素抵抗細(xì)胞對葡萄糖的攝取。Chen等[18]的研究也表明，仙人掌多糖能夠提高胰島素抵抗HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收。

字母不同代表差異顯著(P<0.05)圖3 沙棘多糖對葡萄糖消耗量的影響Figure 3 The effect of seabuckthorn polysaccharides on glucose consumption

2.4 沙棘多糖對糖原含量的影響

糖原是機(jī)體儲存糖的主要形式，糖原合成會使血糖升高，糖原分解會使血糖降低，因此其對維持血糖的相對穩(wěn)定極為重要，同時能夠指示胰島素抵抗?fàn)顩r[19]。如圖4 所示，模型組糖原的相對含量顯著降低(P<0.05)，經(jīng)沙棘多糖處理后能夠顯著提高糖原相對含量(P<0.05)。這主要是由于沙棘多糖提高了細(xì)胞對葡萄糖的攝取，葡萄糖在各種酶的作用下合成糖原，最終導(dǎo)致糖原含量升高。由此可見，沙棘多糖能夠改善胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞中糖代謝紊亂，減輕高糖高脂引起的糖原含量下降。Zhu等[20]研究了苦瓜中水溶性多糖和堿溶性多糖對胰島素抵抗細(xì)胞模型的作用，發(fā)現(xiàn)其也能夠提高糖原含量。

字母不同代表差異顯著(P<0.05)圖4 沙棘多糖對糖原含量的影響Figure 4 The influence of seabuckthorn polysaccharides on glycogen content

2.5 沙棘多糖對SOD、MDA水平的影響

表1為沙棘多糖對HepG2細(xì)胞中SOD、MDA水平的影響，與正常組相比，模型組細(xì)胞中SOD水平顯著下降(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，經(jīng)沙棘多糖處理后的HepG2細(xì)胞SOD水平得到顯著提高(P<0.05)，MDA水平顯著下降(P>0.05)?？赡苁怯捎谏臣嗵蔷哂锌寡趸钚?，因此對細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激相關(guān)酶起到了調(diào)控作用。說明沙棘多糖能夠有效改善胰島素抵抗細(xì)胞模型的氧化應(yīng)激水平。Wei等[21]對沙棘漿果中的多糖進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化活性，并能夠提高小鼠SOD活力，降低MDA活力。

表1 沙棘多糖對HepG2細(xì)胞中SOD、MDA水平的影響?

2.6 沙棘多糖對氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響

環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap1)與核因子E2(Nrf2)在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，激活血紅素加氧酶1(HO-1)的啟動子，HO-1蛋白表達(dá)會在受到氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷后上調(diào)[22]。由圖5可知，模型組中Nrf2和HO-1二者表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Keap1表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，經(jīng)沙棘多糖處理后能夠顯著提高Nrf2和HO-1的表達(dá)水平(P<0.05)，顯著降低Keap1的表達(dá)水平(P<0.05)?？梢?，沙棘多糖能夠調(diào)控胰島素抵抗細(xì)胞模型的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白。其可能機(jī)制如圖6所示，沙棘多糖通過膜蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，Nrf2與Keap1在細(xì)胞質(zhì)中處于結(jié)合狀態(tài)，在受到沙棘多糖刺激后，兩者分開，Keap1留在細(xì)胞質(zhì)中，而Nrf2到細(xì)胞核中與反應(yīng)元件ARE結(jié)合，促進(jìn)下游蛋白HO-1表達(dá)升高，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激及相關(guān)酶的變化。因此推測沙棘多糖是通過調(diào)控Nrf2/HO-1/Keap1信號通路從而起到保護(hù)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。

字母不同代表差異顯著(P<0.05)圖5 沙棘多糖對氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響Figure 5 The effect of seabuckthorn polysaccharides on the expression of oxidative stress protein

圖6 沙棘多糖對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用可能機(jī)制Figure 6 The possible mechanism of the protective effect of seabuckthorn polysaccharides on insulin-resistant HepG2 cells against oxidative stress

3 結(jié)論

沙棘多糖能夠提高HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型中葡萄糖消耗量以及糖原相對含量，提高其超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛水平，改善胰島素抵抗細(xì)胞模型異常糖代謝情況和氧化應(yīng)激水平，并通過調(diào)控環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白/核因子E2/血紅素加氧酶1通路起到改善胰島素抵抗的作用。該試驗(yàn)彌補(bǔ)了沙棘多糖在胰島素抵抗細(xì)胞層面上的空白，但僅從細(xì)胞層面測定了糖代謝的基礎(chǔ)指標(biāo)以及不同氧化酶和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，未在動物層面對其胰島素抵抗作用進(jìn)行研究，后續(xù)將對沙棘多糖在動物水平的胰島素抵抗作用進(jìn)行深入研究。