孫嘉憶, 孫佳祺, 李和平, 顏小捷, 李典鵬, 盧鳳來*

(1.桂林理工大學化學與生物工程學院,廣西 桂林 541006;2.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所,廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室,廣西 桂林 541006)

葫蘆科植物羅漢果(Siraitiagrosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)作為一種具有中國特色的藥用和甜料植物,是國家衛(wèi)生部首批公布的藥食同源中藥材,其果實具有良好的藥用價值,同時具有很強的經(jīng)濟價值[1]。羅漢果除被用作藥材和飲片外,還被制成顆粒、糖漿、膠囊、片劑、酊水劑、散劑等6大劑型共80余種中成藥,涉及數(shù)十家藥企,產(chǎn)值達百億。目前羅漢果的應用及研究都集中在羅漢果的果實上,而每年挖出的根通常被丟棄,造成很大的資源浪費?！吨腥A本草》和《中國民族藥志》等均記載了羅漢果根的主治功能,包括“利濕止瀉;舒筋。主腹瀉;舌胖;腦膜炎后遺癥”,是桂林地區(qū)民間一種標志性藥材[2]。據(jù)目前的文獻[3-6]報道,羅漢果根中的化學成分基本為葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物。課題組前期[7]從羅漢果根中分離得到葫蘆素B等葫蘆素類化合物,該類化合物是葫蘆科植物的代表性成分,具有顯著的抗腫瘤[8]、抗炎[9]、保肝[10]和提高機體免疫力[11]等功效,這類成分很有可能是羅漢果根中的主要活性成分,因此非常有必要進一步明確葫蘆素類化合物的結構,同時獲得單體化合物,為今后藥理活性的進一步研究以及質量控制提供對照品。

目前,羅漢果根化學成分的研究主要采用硅膠柱層析等手段,而硅膠對于皂苷的吸附性較強,死吸附嚴重,不利于樣品的回收。高速逆流色譜(HSCCC)作為一種新型液-液色譜分離技術,無固體載體,具有樣品無損失、無污染、高效快速的優(yōu)點,非常適合植物中天然產(chǎn)物活性成分的分離[12-15]。

基于薄層色譜溶劑選擇法(GUESS)是由Friesen和Pauli教授[16]2005年發(fā)展創(chuàng)立的快速篩選HSCCC溶劑體系的方法。該方法是在硅膠板上采用平衡好的兩相溶劑中的有機層作為展開劑對樣品檢測,以樣品在薄層色譜板(TLC)上的比移值(Rf)來判斷溶劑體系的合理性。與傳統(tǒng)的溶劑選擇方法相比,該方法避免了分配系數(shù)K值的測定及其相關的大量實驗,更簡便易行。

本文通過GUESS選擇溶劑系統(tǒng)并利用液-液萃取與HSCCC結合的方法對羅漢果根中葫蘆素類化合物進行分離純化,縮短了溶劑體系的選擇時間,提高了分離效率,且具有很好的分離效果,值得推廣應用。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜儀(LC-2030C,島津企業(yè)管理(中國)有限公司);超聲波清洗機(SB-5200D,寧波新芝生物科技股份有限公司);電子分析天平(XS225A-SCS,普利賽斯國際貿(mào)易(上海)有限公司);高速逆流色譜儀TBE-300C、低溫恒溫槽DC-0506、恒溫泵TBP-5002(上海同田生物技術有限公司);自動接收儀(CHF161RA,日本Advantec公司);真空離心濃縮儀(miVac,英國Gene Vac公司);超導核磁共振波譜儀(Brucker Avance 500MHz,瑞典Brucker公司);超高效液相色譜-電噴霧離子阱飛行時間質譜聯(lián)用儀(LCMS-IT-TOF,日本Shimadzu公司)。

HPD-100大孔樹脂(賽普銳斯(北京)科技有限公司);RP-C18層析柱(日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司);MCI層析柱(日本三菱化學);硅膠薄層板F254(厚度為0.2 mm,德國默克公司);正己烷(分析純,西隴科學股份有限公司);乙酸乙酯(分析純,廣東光華科技股份有限公司);甲醇(分析純,成都市科隆化學品有限公司);飲用純凈水(娃哈哈股份有限公司);乙腈(色譜純,美國Fisher Scientific公司);氘代吡啶(C5D5N,美國CIL公司,包含0.03%四甲基硅烷(TMS))。

羅漢果根采自廣西桂林永?？h龍江鄉(xiāng),經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所鑒定為葫蘆科屬植物羅漢果的塊根。

1.2 實驗方法

1.2.1提取及樣品預處理

羅漢果塊根洗凈陰干后粉碎,得到羅漢果根粉末2 kg,用70%(體積分數(shù),下同)乙醇水溶液浸提,將提取液濃縮后經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析,依次用純水和20%、40%、60%、80%、100%乙醇水溶液梯度洗脫。將60%乙醇水溶液洗脫部分經(jīng)MCI柱層析,依次用純水和不同體積分數(shù)的甲醇水溶液梯度洗脫(10%～100%,每10%為一個梯度),收集70%～80%甲醇水溶液，將洗脫液經(jīng)RP-C18柱層析分離后,收集富含葫蘆素類化合物的流分,獲得1 g葫蘆素粗品。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶3∶7,v/v/v/v)對葫蘆素粗品進行液-液萃取,對有機相萃取物進行HSCCC分離制備。

1.2.2高速逆流色譜分離條件

稱取280 mg有機相萃取物作為待分離樣品。選擇正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5,v/v/v/v)作為溶劑體系,將兩相溶劑系統(tǒng)在分液漏斗中配制,充分振蕩后分為上下兩相,上相(有機層)作為固定相,下相(水層)作為流動相。將分層后的兩相分別用超聲波清洗機進行超聲脫氣20 min,分別取上下相溶劑各5 mL溶解待分離樣品。以流速30 mL/min將固定相注入螺旋管內,調主機轉速為860 r/min,待固定相充滿整個螺旋管后設流速為2 mL/min,泵入流動相平衡。待流動相從主機出口處流出時,注入溶解后的樣品。溫度設定為30 ℃,檢測波長254 nm。

1.2.3色譜條件和質譜條件

色譜條件:采用分析型Agilent Poroshell120 SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,4 μm,美國Agilent公司);柱溫30 ℃;以乙腈(A)和純水(B)作為流動相,梯度洗脫程序為0～35 min,20%A～50%A;流速0.8 mL/min;檢測波長200 nm。

質譜條件:電離源為電噴霧電離源,負離子模式(ESI-);掃描范圍:m/z200～1 000;噴霧室電壓為-3.5 kV;霧化氣流速為1.50 L/min;曲型脫溶劑管溫度:200 ℃;檢測器電壓:1.70 kV;碰撞誘導解離能量為20 eV。

1.2.4純度測定及結構鑒定

將高速逆流色譜制備得到的樣品旋干后稱重,并用高效液相色譜進行分析檢測,用面積歸一化法測定純度。將樣品用氘代吡啶試劑溶解進行核磁共振和質譜分析,鑒定其化學結構。

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇

將2 kg羅漢果根粉末經(jīng)70%乙醇水溶液浸提,提取液濃縮后以HPD-100大孔樹脂、MCI柱、RP-C18柱層析分離,得到葫蘆素粗品。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶3∶7,v/v/v/v)溶劑體系中分層后的有機相作為展開劑對組分進行TLC分析,用硫酸顯色劑顯色后發(fā)現(xiàn)樣品中一部分成分的Rf值較高,而另一部分的Rf值則幾乎為零,表明樣品中存在極性相差較大的成分,采用這個體系萃取樣品,能將樣品中不同極性的物質分配在兩相中,可極大地減少樣品的復雜性。采用1.2.3節(jié)的方法檢測,證實了葫蘆素粗品萃取前(見圖1a)成分比較復雜,而萃取后的HPLC圖譜顯示有機層和水層中的化學成分顯著不同(見圖1b和圖1c)。該結果表明采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水四元體系對樣品進行萃取預處理可以除去大部分雜質[17]。為進一步純化葫蘆素類成分,采用HSCCC對上相萃取物進行分離制備。

圖1 葫蘆素粗品萃取前后的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of crude cucurbitacins before and after partition a.before partition;b.supper phase extracted by n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (3∶7∶3∶7,v/v/v/v);c.lower phase extracted by n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (3∶7∶3∶7,v/v/v/v).

2.2 HSCCC溶劑體系的選擇

HSCCC能否成功分離化合物取決于溶劑系統(tǒng)的選擇。薄層色譜常應用于逆流色譜分離,對分離得到的流分進行化學成分分析,分析物在薄層硅膠板上的分布與其極性具有很強的相關性。根據(jù)這一原理發(fā)展出來的GUESS法中,化合物在溶劑體系中的K與其Rf值之間有一定對應關系[16]。Liu等[18]通過43種天然產(chǎn)物對Rf與K之間關系的理論模型進行了驗證,結果均表明,Rf的最佳取值范圍應以0.5為中心;驗證了當0.4

本文依據(jù)樣品的極性特征,在不需要計算目標化合物分配系數(shù)的基礎上,采用TLC考察了6種不同體系配比下各目標化合物的Rf值及分離系數(shù)α(見表1)。結果表明,在不同正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水比例的體系中,各化合物的Rf值及α有明顯不同,其在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5,v/v/v/v)與正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4∶6,v/v/v/v)體系中的范圍比其他體系更合理。雖然在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5,v/v/v/v)中,化合物1的Rf值<0.29,但化合物3的Rf值最接近0.5,且各化合物的α均大于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4∶6,v/v/v/v)體系。因此,正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5,v/v/v/v)溶劑系統(tǒng)被認為適合用于HSCCC分離。

表1 化合物在不同溶劑體系中的Rf和αTable 1 Retention factor (Rf)and separation factor (α)values of the compounds in different solvent systems

2.3 HSCCC分離純化的結果

用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶5∶5,v/v/v/v)體系分離樣品,上層溶劑(有機層)作為固定相,下層溶劑(水層)作為流動相,HSCCC的分離情況見圖2。結合流分的TLC檢測結果，將HSCCC圖譜劃分成5個部分。采用1.2.3節(jié)的方法分析并用峰面積歸一法計算各化合物純度,得到的5個化合物(峰1～5)的純度分別為97.0%、95.4%、96.3%、91.6%和95.3%(HPLC色譜圖見圖3);對5個化合物減壓蒸干后進行稱重,得到重量分別為14.73、8.82、30.74、5.03和3.81 mg。

圖2 羅漢果根葫蘆素類化合物的高速逆流色譜圖Fig.2 High speed countercurrent chromatogram (HSCCC)of cucurbitacin compounds in Siraitia grosvenorii roots

圖3 化合物1～5的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of compounds 1-5

2.4 化合物的結構鑒定

將HSCCC分離得到的化合物進行1H-NMR、13C-NMR及質譜分析測定,確定其化學結構,結果如下。

化合物1:白色針狀結晶;[M+HCOO]-(m/z):605.33,相對分子質量為560.33,推測分子式為C32H48O8;1H-NMR (500 MHz,C5D5N)δ:7.41 (d,J=15.8 Hz,H-23),7.38 (d,J=15.8 Hz,H-24),6.33 (d,J=4.83 Hz,3-OH),6.19 (s,16-OH),5.74 (d,J=4.83 Hz,H-6),4.11 (ddd,J=11.4,9.0,4.1 Hz,H-2),3.45 (d,J=9.1 Hz,H-3),3.33 (d,J=14.5 Hz,H-12),3.05 (d,J=7.0 Hz,H-17),2.87 (d,J=14.5 Hz,H-12),2.73 (d,J=13.2 Hz,H-10),2.45 (ddd,J=12.3,3.08,4.0 Hz,H-1),2.35 (m),1.96 (d,J=7.68 Hz,H-8),1.91 (s,25-OAc),1.76 (d,J=12.9 Hz,H-15),1.72 (s),1.58 (s),1.57 (s),1.53 (s),1.49 (s),1.31 (s),1.26 (s),1.23 (s);13C-NMR (126 MHz,C5D5N)δ:213.76 (C-11),204.86 (C-22),170.31 (COCH3),149.90 (C-24),142.94 (C-5),123.00 (C-23),119.22 (C-6),81.91 (C-20),80.33 (C-3),80.26 (C-25),71.50 (C-16),71.27 (C-2),60.14 (C-17),51.60 (C-14),49.55 (C-12),49.36 (C-13),49.08 (C-9),46.86 (C-15),43.72 (C-10),43.29 (C-4),35.14 (C-1),34.92 (C-8),27.06 (C-28),26.68 (C-27),25.96 (C-21),25.94 (C-29),24.68 (C-21),22.91 (C-26),22.21 (COCH3),21.03 (C-19),20.89 (C-30),19.66 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致,鑒定該化合物為葫蘆素Q1,化學結構式如圖4a所示。

圖4 化合物1～5的結構式Fig.4 Chemical structures of compounds 1-5

化合物2:白色針狀結晶;[M+HCOO]-(m/z):607.35,相對分子質量為562.35,推測分子式為C32H50O8;1H-NMR (500 MHz,C5D5N)δ:6.50 (1H,s),5.96 (2H,s),5.75 (1H,d,J=6.3 Hz),4.96 (2H,s),4.13 (1H,s),3.46 (1H,d,J=9.1 Hz),3.34 (2H,dd,J=16.6,13.3 Hz),3.14 (1H,dd,J=11.0,5.1 Hz),2.99 (1H,d,J=7.1 Hz),2.85 (1H,d,J=14.5 Hz),2.74 (1H,d,J=13.1 Hz),2.47 (2H,dt,J=10.6,5.6 Hz),2.36 (2H,m),1.92 (3H,s),1.73 (1H,d,J=13.0 Hz),1.63 (2H,s),1.58 (2H,s),1.56 (3H,s),1.51 (8H,d,J=10.6 Hz),1.32 (3H,s),1.26 (6H,d,J=11.1 Hz);13C-NMR (126 MHz,C5D5N)δ:215.61 (C-22),213.64 (C-11),170.62 (COCH3),142.93 (C-5),119.21 (C-6),82.09 (C-20),81.90 (C-3),80.66 (C-25),71.49 (C-2),70.88 (C-16),59.47 (C-17),51.56 (C-14),49.75 (C-12),49.32 (C-13),49.20 (C-9),46.89 (C-15),43.60 (C-10),43.29 (C-4),35.88 (C-24),35.15 (C-1),34.91 (C-8),32.66 (C-23),26.53 (C-28),26.43 (C-26),25.99 (C-27),25.95 (C-21),24.64 (C-7),22.92 (COCH3),22.67 (C-29),20.89 (C-18),20.84 (C-19),19.65 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道基本一致,鑒定該化合物為23,24-二氫葫蘆素F-25-乙酸酯,化學結構如圖4b所示。

化合物3:淡黃色針狀結晶;[M+HCOO]-(m/z):603.32,相對分子質量為558.32,推測分子式為C32H46O8;1H-NMR (500 MHz,C5D5N)δ:7.41 (1H,m),7.38 (1H,m),1.92 (3H,s,COCH3),1.73 (3H,s,H-21),1.60 (3H,s,H-2),1.57 (3H,s,H-2),1.54 (3H,s,H-26),1.46 (3H,s,H-28),1.30 (3H,s,H-29),1.22 (3H,s,H-19),1.14 (3H,s,H-1);13C-NMR (126 MHz,C5D5N)δ:213.6 (C-3),213.3 (C-11),204.8 (C-22),150.4 (C-24),141.7 (C-5),122.9 (C-23),120.6 (C-6),80.2 (C-25),80.1 (C-20),72.8 (C-2),71.1 (C-16),70.2 (COCH3),60.3 (C-17),51.4 (C-14),51.3 (C-4),49.5 (C-12),49.2 (C-9),49.0 (C-13),46.7 (C-15),43.3 (C-8),37.3 (C-1),34.6 (C-10),29.8 (C-28),26.9 (C-27),26.6 (C-26),26.0 (C-21),24.6 (C-7),22.2 (COCH3),22.1 (C-29),21.0 (C-18),20.4 (C-19),19.3 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道基本一致,鑒定該化合物為葫蘆素B,化學結構式如圖4c所示。

化合物4:白色針狀結晶;[M+HCOO]-(m/z):605.33,相對分子質量為560.33,推測分子式為C32H48O8;1H-NMR (500 MHz,C5D5N)δ:6.54 (1H,d,J=4.6 Hz),6.39 (1H,d,J=4.4 Hz),6.04 (1H,s),5.71 (1H,dd,J=5.7,2.4 Hz),3.35 (2H,m),3.10 (2H,m),2.98 (1H,d,J=7.1 Hz),2.90 (1H,d,J=14.5 Hz),2.70 (1H,ddd,J=12.3,5.8,3.5 Hz),2.47 (1H,ddd,J=15.3,11.0,4.6 Hz),2.35 (2H,m),1.96 (2H,d,J=7.5 Hz),1.93 (3H,s,COCH3),1.71 (2H,m),1.63 (3H,s,H-30),1.58 (3H,s,H-21),1.52 (3H,s,H-27),1.50 (3H,s,H-26),1.46 (3H,s,H-28),1.32 (3H,s,H-29),1.24 (3H,s,H-19),1.14 (3H,s,H-18);13C-NMR (126 MHz,C5D5N)δ:215.63 (C-22),213.70 (C-3),213.33 (C-11),170.60 (COCH3),141.78 (C-5),120.65 (C-6),82.09 (C-25),80.64 (C-20),72.91 (C-2),70.81 (C-16),59.61 (C-17),51.46 (C-14),51.40 (C-4),49.79 (C-13),49.27 (C-9),49.20 (C-12),46.80 (C-15),43.30 (C-8),37.40 (C-1),35.87 (C-24),34.73 (C-10),32.74 (C-23),29.91 (C-28),26.52 (C-27),26.44 (C-26),26.03 (C-21),24.63 (C-7),22.68 (COCH3),22.31 (C-29),20.85 (C-19),20.49 (C-18),19.45 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道基本一致,鑒定該化合物為23,24-二氫葫蘆素B,化學結構式如圖4d所示。

化合物5:白色針狀結晶;[M+HCOO]-(m/z):605.33,相對分子質量為560.33,推測分子式為C32H48O8;1H-NMR (500 MHz,C5D5N)δ:5.96 (1H,m,H-6),5.04 (1H,m,H-16),4.28 (1H,s,H-3),1.93 (3H,s,COCH3),1.62 (3H,s,H-30),1.53 (3H,s,H-21),1.52 (3H,s,H-27),1.51 (3H,s,H-26),1.49 (3H,s,H-28),1.24 (3H,s,H-29),1.22 (3H,s,H-19),1.10 (3H,s,H-18);13C-NMR (126 MHz,C5D5N)δ:215.50 (C-22),213.10 (C-11),211.31 (C-2),170.63 (COCH3),139.80 (C-5),121.96 (C-6),82.08 (C-3),81.47 (C-20),80.58 (C-16),70.76 (C-25),59.40 (C-17),51.38 (C-14),49.69 (C-9),49.25 (C-12),49.06 (C-13),47.34 (C-4),46.76 (C-15),43.53 (C-8),40.26 (C-1),37.01 (C-24),35.87 (C-10),32.64 (C-23),26.53 (C-27),26.44 (C-26),25.96 (C-21),25.02 (C-29),24.57 (C-7),22.68 (C-28),22.40 (COCH3),20.86 (C-30),20.43 (C-18),19.34 (C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道基本一致,鑒定該化合物為二氫異葫蘆素B-25乙酸酯,化學結構如圖4e所示。

3 結論

利用液-液萃取與HSCCC對羅漢果根中葫蘆素類化合物進行分離純化,一次進樣即可得到5種高純度的葫蘆素類化合物,分別為葫蘆素Q1、23,24-二氫葫蘆素F-25-乙酸酯、葫蘆素B、23,24-二氫葫蘆素B、二氫異葫蘆素B-25乙酸酯。本方法簡單快速,分離效果好,為分離葫蘆素類化合物提供了新的高效制備方法,同時也為羅漢果的合理開發(fā)利用提供了技術支撐,具有較好的應用價值。