王夢夢, 謝琳娜, 朱英, 陸一夫

(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所,北京 100021)

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs),是一種持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs),根據(jù)苯環(huán)上溴原子的取代個(gè)數(shù)和位置的不同,共有10類209種同系物。由于其阻燃性能良好,被廣泛應(yīng)用于紡織品、玩具、建筑材料和電子設(shè)備等產(chǎn)品中[1,2]。PBDEs的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,親脂性強(qiáng),容易釋放到環(huán)境中,并通過食物鏈對(duì)生物體產(chǎn)生生物蓄積與生物放大作用,產(chǎn)生甲狀腺毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌毒性、生殖毒性、肝臟毒性、細(xì)胞毒性、致癌性等[3-10]。

PBDEs對(duì)人體健康的影響已成為世界范圍內(nèi)高度關(guān)注的問題,目前針對(duì)多溴聯(lián)苯醚人群暴露情況的研究,分析樣本主要為血液、母乳和各種組織(脂肪、胎盤等)[11]。由于多溴聯(lián)苯醚是脂溶性化合物,在尿液中含量較低且多以羥基化代謝物的形式存在,脂肪組織的采樣具有侵害性,且母乳和胎盤的采樣僅限于一部分特殊人群,而血液樣本相對(duì)較易獲得,所以血液樣本的測定是研究多溴聯(lián)苯醚對(duì)人群健康影響的主要途徑。

人體血清基質(zhì)復(fù)雜,PBDEs含量較低,因此需提高富集效率并盡可能降低基質(zhì)干擾,提高檢測靈敏度。目前,液液萃取法、固相萃取法和加速溶劑萃取法是樣品提取時(shí)較常使用的方法,樣品凈化主要使用凝膠色譜法和固相萃取柱凈化法,檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[12,13]、氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法(GC-NCI/MS)[14]和氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜法(GC-HRMS)[15,16]。LC-MS前處理步驟相對(duì)簡便,但對(duì)PBDEs分辨能力較弱、靈敏度較低,更適合易熱降解的高溴代多溴聯(lián)苯醚的測定;GC-MS/MS、GC-NCI/MS選擇性、靈敏度較高,對(duì)復(fù)雜基質(zhì)抗干擾能力強(qiáng),適用于痕量PBDEs的測定,但樣本需求量較大,需采集2～5 mL血清樣本;GC-HRMS同時(shí)備有靜電場離子分析器和磁場質(zhì)量分析器,因而使儀器同時(shí)具有能量聚焦和方向聚焦的雙聚焦功能,靈敏度高、檢出限低,適用于小體積樣本中痕量和超痕量PBDEs的測定。目前常用的GC-HRMS樣品前處理步驟中主要采用凝膠色譜和酸性硅膠柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化,其中凝膠色譜法樣本需求量較大(2 mL),酸性硅膠柱對(duì)實(shí)驗(yàn)人員填裝操作要求較高,且無法同時(shí)測定多種PBDEs組分(如BDE-209等),批量樣品檢測時(shí)效率較低。本方法探索使用少量血清(0.5 mL),采用GC-HRMS結(jié)合液液萃取和硅膠柱凈化的方法,建立了人血清中14種PBDEs的測定方法,并用該方法對(duì)某地區(qū)15份青少年人群血樣進(jìn)行了檢測,以期了解該地區(qū)青少年人群PBDEs的暴露水平。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Autospec Premier氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜儀(美國Waters公司),JA2003電子天平(上海舜宇恒平公司),FV64氮吹儀(廣州得泰公司),600C離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司),HyperSep Silica固相萃取柱(6 mL,500 mg)(美國Thermo公司)。

正己烷、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、甲醇、壬烷(色譜純,美國Merck公司),超純水(德國Merck公司),硫酸(分析純,中國國藥公司),標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM1958(美國NIST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。

14種PBDEs(包括BDE-17、BDE-28、BDE-47、BDE-66、BDE-71、BDE-85、BDE-99、BDE-100、BDE-138、BDE-153、BDE-154、BDE-183、BDE-190、BDE-209)購自美國AccuStandard公司;13C標(biāo)記的10種PBDEs (包括13C12-BDE-28、13C12-BDE-47、13C12-BDE-77、13C12-BDE-99、13C12-BDE-100、13C12-BDE-138、13C12-BDE-153、13C12-BDE-154、13C12-BDE-183和13C12-BDE-209)購自美國Cambridge Isotope Laboratories公司。

血清樣本:采集對(duì)象為某地區(qū)15名健康青少年,均告知研究目的并簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

PBDEs標(biāo)準(zhǔn)使用溶液:以壬烷為溶劑配成BDE-209質(zhì)量濃度為5 mg/L、其他13種目標(biāo)物質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

PBDEs內(nèi)標(biāo)使用溶液:以甲苯為溶劑配成13C12-BDE-209質(zhì)量濃度為500 μg/L、其他9種13C標(biāo)記的PBDEs質(zhì)量濃度為50 μg/L的內(nèi)標(biāo)使用液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

血清樣品解凍后移取0.5 mL于12 mL玻璃離心管中,分別加入200 μL硫酸、0.5 mL甲醇和20 μL內(nèi)標(biāo)使用溶液后混勻。先加入6 mL正己烷充分搖振后,以3 500 r/min離心10 min,收集上層有機(jī)相;再加入6 mL甲基叔丁基醚,重復(fù)萃取,合并兩次萃取液,于40 ℃、5 Pa氮吹25 min至0.5 mL。依次用2 mL甲醇和2 mL正己烷活化硅膠固相萃取柱,將濃縮液轉(zhuǎn)移到硅膠柱上,先收集流出液,再用10 mL二氯甲烷-正己烷(1∶1,v/v)溶液洗脫,合并流出液與洗脫液,40 ℃氮吹30 min至近干。向試管中加入10 μL正己烷復(fù)溶,振蕩混勻,轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣小瓶中,待測。

1.3.2色譜條件

色譜柱:Rtx-1614毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm);進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度:290 ℃;傳輸線溫度:320 ℃;升溫程序:初始溫度150 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升溫至250 ℃,保持1 min,再以25 ℃/min升溫至290 ℃,保持3 min,然后以25 ℃/min升溫至320 ℃,保持12.5 min;載氣:氦氣,恒定流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源,源溫:280 ℃;電子能量:35 eV;電壓選擇離子檢測(VSIR);分辨率:10 000。14種PBDEs及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 14種PBDEs及其同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS parameters of the 14 polybrominated diphenyl ethers (PBDEs)and their corresponding isotope internal standards

1.4 質(zhì)量控制

樣品前處理環(huán)境應(yīng)在每次實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后進(jìn)行清理,避免有目標(biāo)物殘留。實(shí)驗(yàn)過程中所用玻璃離心管、試劑、進(jìn)樣小瓶、固相萃取柱、槍頭均做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn),未檢出14種待測PBDEs。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

目前PBDEs的氣相色譜-質(zhì)譜檢測通常需用兩根不同的非極性色譜柱完成。這是因?yàn)锽DE-209熱穩(wěn)定性較差,易在色譜柱中分解,一般采用15 m或更短的色譜柱有利于縮短柱分離時(shí)間并提高響應(yīng),其他組分使用30 m的色譜柱進(jìn)行分離,檢測過程中需頻繁切換色譜柱,效率較低。本研究采用Rtx-1614毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm),相比常用的DB-5MS等非極性色譜柱,在保證低溴代組分分離完好的前提下,縮短柱分離時(shí)間,可有效防止BDE-209在色譜柱上的分解,可滿足同時(shí)測定多種PBDEs的需求,提高檢測效率。

2.1.2色譜條件的選擇

多溴聯(lián)苯醚沸點(diǎn)較高,沸程較寬(310～425 ℃),程序升溫過快,低溴代組分保留時(shí)間接近,不能較好分離;柱溫過低,高沸點(diǎn)組分不能完全氣化,響應(yīng)會(huì)明顯降低;柱溫過高會(huì)加速柱流失,降低柱效,縮短色譜柱使用壽命,因此升溫程序的最高溫度不宜超過320 ℃。分別比較了程序升溫最高溫度為300、310和320 ℃時(shí)目標(biāo)物響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)320 ℃時(shí)可明顯提高高沸點(diǎn)組分(BDE-190和BDE-209)的響應(yīng)(見圖1),同時(shí)縮短了BDE-209的柱分離時(shí)間,防止其在色譜柱上的分解。

圖1 升溫程序最高溫度對(duì)部分目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響Fig.1 Effects of maximum temperature of temperature program on the response values of the target compounds

經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn),綜合考慮各組分的分離度、靈敏度及分析時(shí)間等因素,最終選擇初始溫度150 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升到250 ℃,保持1 min,再以25 ℃/min升到290 ℃,保持3 min,最后以25 ℃/min升到320 ℃,保持12.5 min的三階升溫模式。各組分分離度良好,14種PBDEs和10種相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖見圖2。

圖2 (a)14種PBDEs和(b)同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of (a)the 14 PBDEs and (b)their isotope internal standards a.The mass concentrations of 13 PBDEs were 50 μg/L and that of BDE-209 was 250 μg/L;b.The mass concentrations of the isotope internal standards of 13 PBDEs were 50 μg/L and that of 13C12-BDE-209 was 250 μg/L.

2.1.3質(zhì)譜條件的選擇

分別考察了離子源溫度分別為280、290和300 ℃時(shí),目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度變化。溫度較高時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較小的大部分化合物碎片離子較多,用于定性和定量的離子豐度下降;但相對(duì)分子質(zhì)量較大的化合物離子豐度較高。綜合這兩方面的因素,本方法離子源溫度設(shè)為280 ℃。

對(duì)傳輸線溫度進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)溫度變化對(duì)低溴代組分影響較小,對(duì)高溴代組分影響較大,尤其是BDE-209,隨著傳輸線溫度的升高不僅出峰時(shí)間加快,響應(yīng)也明顯提高(見圖3),最終傳輸線溫度設(shè)為320 ℃。

圖3 傳輸線溫度對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響Fig.3 Effects of transmission line temperature on the response values of the target compounds

在特征碎片離子的確定過程中,重點(diǎn)優(yōu)化了BDE-209特征碎片離子的選擇。通過對(duì)比不同碎片離子響應(yīng),最終選擇響應(yīng)最強(qiáng)的BDE-209脫掉兩個(gè)溴離子的碎片離子[M-2Br]+,即m/z799作為監(jiān)測離子(見圖4)。

圖4 監(jiān)測離子對(duì)BDE-209響應(yīng)值的影響Fig.4 Effects of monitoring ion on the response values of the target compounds

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1萃取條件的選擇

酸化條件 由于人體血液樣品中多溴聯(lián)苯醚含量低,且樣品基質(zhì)復(fù)雜,常采用多層硅膠柱進(jìn)行凈化[17]。但由于無相應(yīng)的商品化產(chǎn)品,需人工填裝,過程繁瑣,重復(fù)性較差,大批量樣本檢測時(shí)效率較低。本實(shí)驗(yàn)采用柱前加酸的方式完成去脂凈化,分別比較了甲酸、硫酸和鹽酸的去脂效果和回收率。結(jié)果表明,甲酸的效果較差,固相萃取凈化時(shí)易堵塞萃取柱,硫酸和鹽酸去脂效果和回收率均較好,但采用硫酸酸化后,高溴代組分如BDE-190和BDE-209的響應(yīng)更好,故選用硫酸酸化法去脂。

萃取溶劑 選擇常用的萃取溶劑正己烷和甲基叔丁基醚,比較了正己烷(12 mL)、甲基叔丁基醚(12 mL)和正己烷(6 mL)-甲基叔丁基醚(6 mL)對(duì)回收率的影響。結(jié)果(見圖5)表明,單獨(dú)使用正己烷或甲基叔丁基醚時(shí),BDE-17等低溴代組分的回收率較差。最終選用正己烷(6 mL)-甲基叔丁基醚(6 mL)作為萃取溶劑。

圖5 萃取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響(n=6)Fig.5 Effects of extraction solvent on the recoveries of the target compounds (n=6)

2.2.2固相萃取柱的選擇

液液萃取后需使用固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行富集凈化,不同類型的填充料對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。本研究比較了填充料為硅膠和氧化鋁的固相萃取柱的凈化效果和對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明,相比于氧化鋁固相萃取柱,使用硅膠固相萃取柱時(shí)各組分回收率更好(見圖6)。

2.2.3洗脫溶劑的選擇

洗脫溶劑的極性影響目標(biāo)物的洗脫效果。本方法比較了常用洗脫溶劑正己烷、二氯甲烷和正己烷-二氯甲烷(1∶1,v/v)對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明,洗脫溶劑選擇正己烷-二氯甲烷(1∶1,v/v)時(shí)效果最好(見圖7)。

圖7 洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響(n=6)Fig.7 Effects of elution solvent on the recoveries of the target compounds (n=6)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍和檢出限

用正己烷配制目標(biāo)分析物質(zhì)量濃度分別為4、10、25、50、100和250 μg/L,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(BDE-209及其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍),換算到人血清中的質(zhì)量濃度分別為0.08、0.2、0.5、1、2和5 μg/L(BDE-209質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍)。按照本方法儀器分析條件進(jìn)行測定,以目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)離子峰的峰面積之比為縱坐標(biāo),目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,14種PBDEs的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

參照美國疾病預(yù)防控制中心關(guān)于方法檢出限計(jì)算的要求,對(duì)質(zhì)量濃度為預(yù)估方法檢出限3～5倍的樣品重復(fù)測定n次(n≥7),以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法檢出限,10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限。本方法檢出限為0.01～0.51 μg/L,定量限為0.04～1.70 μg/L,結(jié)果見表2。

表2 14種PBDEs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限(MDL)和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (r),method detection limits (MDLs),and limits of quantification (LOQs)of the 14 PBDEs

2.3.2加標(biāo)回收率和精密度

以胎牛血清為基質(zhì)進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8 μg/L(BDE-209質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍),每個(gè)水平平行測定6次,考察日內(nèi)精密度,連續(xù)測定6天,考察日間精密度。14種PBDEs的平均回收率為75.5%～120.7%,日內(nèi)和日間精密度分別為3.8%～10.9%和4.2%～12.4%,結(jié)果見表3。

2.3.3正確度評(píng)價(jià)

用本方法測定美國NIST人血清標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM1958,與其參考值進(jìn)行比較,結(jié)果均在參考值范圍內(nèi)(見表4)。

表4 SRM1958測定值與參考值比較(n=6)Table4 ComparisonofexperimentalresultsandcertifiedvaluesofSRM1958(n=6)CompoundExperimentalresult/(ng/g)Certifiedvalue/(ng/g)BDE-170.4530.458±0.032BDE-280.4660.462±0.019BDE-470.6560.651±0.029BDE-660.4710.440±0.041BDE-990.4840.492±0.015BDE-1000.4890.475±0.027BDE-1530.4120.455±0.054BDE-1540.4180.441±0.039BDE-1830.4250.453±0.042 NIST:NationalInstituteofStandardsandTechnology.

2.4 方法比較

對(duì)本方法和文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行比較,本方法共有3個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)樣本需求量少:由于血清采集較難獲得大量樣本,本方法僅需0.5 mL血清樣本,更適用于PBDEs暴露對(duì)人體健康影響的研究。(2)檢測效率顯著提高:目前PBDEs的檢測需用兩根不同的非極性色譜柱完成,實(shí)際應(yīng)用過程中需要頻繁切換色譜柱,本方法可對(duì)包括BDE-209在內(nèi)的14種PBDEs同時(shí)測定,可有效提高檢測效率。(3)方法靈敏度高:與文獻(xiàn)報(bào)道方法[18-20]相比,本方法在減少取樣量的基礎(chǔ)上,可同時(shí)測定高溴代組分(如BDE-209),方法檢出限較低,可滿足實(shí)際樣品檢測的需求。

比較結(jié)果見表5。

表5 本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的血清中PBDEs檢測方法的比較Table 5 Comparison of the developed method with other reported methods for the determination of PBDEs in serum samples

2.5 實(shí)際樣品測定

對(duì)某地區(qū)15份青少年人群的血清樣本進(jìn)行檢測,BDE-47檢出率為100%,含量范圍為1.86～4.66 ng/g(以脂重計(jì)),其他13種PBDEs均未檢出。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,中國普通人群血清中PBDEs單體含量在0.01～14.6 ng/g(以脂重計(jì))之間[21-23],其中檢出率最高的為BDE-47。本研究樣品測定的結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)色譜條件、質(zhì)譜條件和固相萃取柱類型、萃取和洗脫溶劑組成等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了液液萃取-氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜測定人體血清中14種PBDEs的分析方法。本方法樣本量需求較少(0.5 mL),操作簡便,靈敏度和精密度可滿足實(shí)際樣品大批量檢測的需求。