賈文燕, 唐明華, 章俊輝, 袁黎明

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,云南 昆明 650500)

手性分離一直都是分離分析研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1],手性分離在制藥、食品、化學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。例如在藥物方面[2],用于臨床的2 000多種藥品中,就有500多種為外消旋體,手性藥物的構(gòu)型與細(xì)胞中的受體相匹配極為關(guān)鍵,如果不匹配,可能會降低藥效,甚至?xí)a(chǎn)生相反的藥理作用,對人體造成傷害,所以手性藥物的拆分顯得尤為重要。毛細(xì)管電泳具有高效率、低能耗、分離模式多樣等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)發(fā)展成為手性分離最具應(yīng)用前景的方法之一。毛細(xì)管電色譜(CEC)是結(jié)合了毛細(xì)管電泳與高效液相色譜優(yōu)點(diǎn)而發(fā)展起來的一種分離分析方法,色譜柱由外層涂敷著聚酰亞胺、內(nèi)徑為25～100 μm的熔融石英管制成。石英色譜柱具有電阻大、內(nèi)徑小、比表面積大等特點(diǎn),使得CEC可以在微電流、高電壓的環(huán)境下工作。與HPLC相比,其分析用樣品量較少,分離效率更高,分析成本更低,故CEC被廣泛運(yùn)用于化學(xué)、環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域[3,4]。

多孔有機(jī)籠(POCs)[5,6]是通過亞胺鍵、碳碳鍵、硼酸酯鍵等共價(jià)鍵連接、依靠分子間堆積組裝而成的多孔材料。該多孔材料的形狀一般為四面體、八面體、十二面體、球型。但是由于形成的多孔材料[7,8]中的亞胺鍵不穩(wěn)定,易發(fā)生水解,尤其是在酸性或堿性環(huán)境下,因此大大限制了多孔材料的應(yīng)用。為解決這一問題,Cooper等[9]通過一種合成策略,將多孔有機(jī)籠的頂點(diǎn)與含羰基的物質(zhì)(如乙醛)結(jié)合在一起,以此來維持晶體的穩(wěn)定性,使其孔隙大小不發(fā)生改變。

目前,構(gòu)筑手性POCs材料主要有兩種方法:利用金屬離子或者金屬簇與純光學(xué)手性有機(jī)配體通過自組裝堆積形成;通過誘導(dǎo)引入手性基團(tuán),以非手性有機(jī)模板作為橋連配體組裝堆積合成[10],用伯胺與醛或者酮發(fā)生席夫堿反應(yīng)獲得有機(jī)分子胺籠[11,12],且胺籠上的氨基較為活潑,為后期衍生和將POCs功能化提供了很多可能性。

POCs是一種較為理想的手性固定相材料。2015年,Yuan課題組[13]將多孔有機(jī)分子籠CC3-R用作毛細(xì)管氣相色譜手性固定相,證實(shí)了該材料對手性物質(zhì)有良好的分離能力。Kewley等[14]報(bào)道了POCs在氣相色譜(GC)和電色譜中的應(yīng)用,證明了POCs是一種可靠的拆分材料。2019年有文獻(xiàn)[15]報(bào)道將POCs用于液相色譜分離手性化合物,并取得了不錯的分離效果。POCs在吸附、分離、傳感和催化等方面也有許多潛在運(yùn)用[16],揭示POCs的廣闊應(yīng)用前景。

POCs與沸石、金屬-有機(jī)骨架、共價(jià)有機(jī)骨架、介孔二氧化硅等多孔材料不同,POCs在大部分有機(jī)溶劑中都能溶解。本文將POCs用于毛細(xì)管電色譜固定相,涂敷在毛細(xì)管內(nèi)壁制成色譜柱,通過拆分外消旋體、位置異構(gòu)體來研究其分離性能。通過緩沖溶液的濃度、操作電壓以及pH值的變化來探究其對4種手性藥物拆分效果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

CL 1020高效毛細(xì)管電泳儀(北京華陽利民儀器有限公司);Bruker DXR 500 MHz核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司);D/Max 2000粉末衍射儀(日本Rigaku公司);Vario EL Ⅲ有機(jī)化學(xué)元素分析儀(北京來亨科貿(mào)有限責(zé)任公司);SDT-650熱重分析儀(美國TA儀器);XL 30 ESEM-TMP掃描電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司);純水器(英國Elga公司)。

三氟乙酸、1R,2R-1,2-二苯基乙二胺、硫脲、苯酚、六亞甲基四胺、氘代氯仿(CDCl3)、氘代二甲亞砜(DMSO-d6)購于上海Adamas試劑有限公司;二氯甲烷、甲醇、二甲亞砜(DMSO)、氫氧化鈉、2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛、三氯甲烷、鹽酸和磷酸(H3PO4)均購于天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司;生物緩沖劑三羥基甲基氨基甲烷(Tris)購于北京Solarbio公司;吡喹酮、二氫黃酮、萘普生、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺均購于比利時(shí)Acros Organics公司;位置異構(gòu)體:o,m,p-碘苯胺、o,m,p-硝基苯胺購于上海Aladdin試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑純度均≥99%。

1.2 2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛的合成

參考文獻(xiàn)[17]方法合成2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛。在N2保護(hù)下,稱取2.96 g (0.028 mol)苯酚與8.6 g (0.061 mol)六亞甲基四胺,加入30 mL三氟乙酸,于130 ℃油浴中攪拌24 h。將反應(yīng)升溫至150 ℃攪拌2.5 h后冷卻至120 ℃,加入50 mL 4 mol/LHCl,靜置12 h后獲得淡黃色粉末,依次用甲醇、1 mol/L HCl、二氯甲烷洗滌得到2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛。

1.3 多孔有機(jī)籠的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[18]方法合成POCs。將0.171 g (0.001 5 mol)1R,2R-二苯基乙二胺充分溶解在30 mL DMSO與3 mL三氯甲烷的混合溶液中,緩慢加入0.178 g (0.001 mol)2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛,然后加入0.01 mL三氟乙酸,并將上述混合物在室溫下攪拌14 d。獲得的橙色固體進(jìn)行真空干燥后即可得到目標(biāo)粗產(chǎn)物POCs,為了得到高純度產(chǎn)品,依次用三氯甲烷、乙醚洗滌。合成路線見圖1。

圖1 POCs的合成路線Fig.1 Synthesis route of porous organic cages (POCs)

1.4 多孔有機(jī)籠開管柱的制備

用1 mol/L NaOH溶液沖洗熔融石英毛細(xì)管2 h使其內(nèi)壁粗糙化,接著用高純水和0.1 mol/L HCl各沖洗1 h,再用高純水沖洗至中性,最后將粗糙化后的石英毛細(xì)管柱用氮?dú)庠?20 ℃下吹干、冷卻后備用。

將POCs溶解于二氯甲烷溶液中,過濾。采用動態(tài)涂漬法[19]將該溶液在氮?dú)獾耐苿酉峦ㄟ^上述內(nèi)壁被粗糙化處理的毛細(xì)管,使其在管壁內(nèi)形成一層濕的涂層,繼續(xù)用氮?dú)饬鲗⒚?xì)管吹干,放入氣相色譜柱溫箱中進(jìn)行老化,從30 ℃開始升溫,以1 ℃/min的速率升至200 ℃,并在該溫度下保持4 h,冷卻后即得到所需的POCs開管柱。

1.5 毛細(xì)管電色譜實(shí)驗(yàn)條件

截取58 cm上述POCs開管柱(內(nèi)徑75 μm),在距末端8 cm處開窗,使該色譜柱的有效分離長度為50 cm。所用緩沖溶液均為Tris-H3PO4,電滲流標(biāo)記物選用2 mg/mL硫脲。初次使用該色譜柱時(shí),依次用去離子水、緩沖溶液沖洗色譜柱直至基線平穩(wěn)。每次進(jìn)樣前,用緩沖溶液對色譜柱進(jìn)行沖洗,以保證色譜柱的高效性與重復(fù)性。進(jìn)樣采用虹吸的方法,進(jìn)樣高差為5 cm,進(jìn)樣時(shí)間為2 s,樣品的檢測波長為254 nm。

拆分二氫黃酮、吡喹酮、萘普生和3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺的工作電壓分別為13、14、14和12 kV;二氫黃酮適宜緩沖溶液濃度為0.075 mol/L,吡喹酮、萘普生和3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺為0.100 mol/L;4種手性樣品拆分時(shí)的pH值均為3.51。

2 結(jié)果與討論

2.1 2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛的結(jié)構(gòu)表征

將2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛溶解于DMSO進(jìn)行核磁共振實(shí)驗(yàn)。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6):δ10.33 (s,2H,OH),10.02 (s,1H,CHO),8.56 (s,2H,Ar-H);13C NMR (125 MHz,DMSO-d6):δ192.14、191.18、166.74、137.77、128.58、124.75。上述所得數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致,表明已經(jīng)成功合成2-羥基-1,3,5-均苯三甲醛。

2.2 POCs的結(jié)構(gòu)表征

采用核磁共振、紅外光譜、X射線粉末衍射(XRD)等方法對合成的POCs進(jìn)行表征。將POCs溶解于CDCl3中測得核磁共振氫譜,1H NMR (500 MHz,CDCl3):δ8.80～8.56 (m,4H),8.38～8.25 (m,4H),8.10～8.03 (m,4H),7.94～7.86 (m,8H),3.46～3.24 (m,12H),1.83～1.46 (m,48H),所得數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致。

在紅外光譜圖2a中,1 602、1 489和1 458 cm-1處的吸收峰由苯環(huán)中C=C-H和C=C拉伸振動產(chǎn)生。1 636 cm-1處較強(qiáng)的特征吸收峰為亞胺鍵(C=N)拉伸帶,位于2 900 cm-1左右的兩峰為C-H產(chǎn)生,位于3 420 cm-1處的吸收峰是-OH拉伸帶,所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道結(jié)果一致。圖2b是XRD測試圖,POCs粉末衍射數(shù)據(jù)與模擬數(shù)據(jù)一致。以上測試均表明已經(jīng)成功合成了POCs。

圖2 POCs的(a)紅外光譜圖和(b)X射線粉末衍射圖Fig.2 (a)IR spectrum and (b)X-ray powder diffraction (XRD)pattern of POCs

為考察該多孔有機(jī)籠的熱穩(wěn)定性,將熱重儀的參數(shù)設(shè)置成以1 min/℃從室溫升至800 ℃,進(jìn)行熱重分析,從圖3可以看到,該材料在大約380 ℃時(shí)才開始分解,熱穩(wěn)定性好,電泳中產(chǎn)生的焦耳熱對其穩(wěn)定性沒有影響,適于做手性開管毛細(xì)管柱。

圖3 POCs熱重曲線圖Fig.3 Thermogravimetric curve of POCs

2.3 POCs的氮?dú)馕綔y試

該多孔有機(jī)籠是一種具有四面體結(jié)構(gòu)的多孔材料,為測試其比表面積、空腔體積及孔徑大小,進(jìn)行氮?dú)馕綄?shí)驗(yàn),結(jié)果見圖4。POCs的比表面積為209.91 m2/g,孔體積為0.078 cm3/g,孔徑大小為1.98 nm。說明POCs比表面積較大,適用于一般有機(jī)化合物的分離。

圖4 POCs的(a)氮?dú)馕矫摳降葴鼐€和(b)孔徑分布曲線Fig.4 (a)Nitrogen adsorption and desorption isotherms and (b)pore size distribution curves of POCs

2.4 POCs毛細(xì)管柱掃描電鏡表征

為觀察POCs在毛細(xì)管內(nèi)壁的涂漬情況,將制成的色譜柱進(jìn)行掃描電鏡分析(見圖5),對比未涂敷的空毛細(xì)管柱與已經(jīng)涂敷了POCs手性固定相的色譜柱掃描電鏡圖,可以明顯看到毛細(xì)管內(nèi)壁已經(jīng)涂敷上一層厚度較為均勻的POCs材料。

圖5 石英毛細(xì)管柱掃描電鏡圖Fig.5 SEM of quartz capillary columnsa.empty column;b.POCs chiral column.

2.5 POCs色譜柱對手性化合物的拆分

POCs的手性識別能力,可能是受到該多孔有機(jī)籠獨(dú)特的手性結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)的影響。在弱范德華力的作用下,通過分子之間的自組裝形成了具有四面體結(jié)構(gòu)的多孔材料。當(dāng)外消旋體進(jìn)入到毛細(xì)管色譜柱中,與分子籠的表面或內(nèi)部充分接觸時(shí),偶極-偶極之間的相互作用，以及π-π鍵、氫鍵等的相互作用會對手性分離產(chǎn)生影響。此外,較弱的范德華力也會產(chǎn)生一定影響?？傊鸱质中苑肿邮且粋€較為復(fù)雜的過程,涉及許多影響因素,但不可否認(rèn)的是手性固定相在其中起到的作用是無可替代的。

為了探究該色譜柱對手性化合物的拆分能力,選用二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、萘普生和吡喹酮為樣品,改變實(shí)驗(yàn)中的分離電壓、緩沖溶液濃度、緩沖溶液pH值,優(yōu)化拆分4種外消旋體的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.5.1分離電壓對手性化合物拆分的影響

選用0.100 mol/L、pH 3.51的Tris-H3PO4緩沖體系,考察工作電壓(10～20 kV)對分離對映異構(gòu)體的影響。從表1部分?jǐn)?shù)據(jù)可知,分離度(Rs)先是隨著電壓的增加而增加,但隨后分離度降低。增加操作電壓,可以使電滲流增大,從而縮短樣品出峰時(shí)間和增加分離度,但是過大的電流會加大焦耳熱,降低化合物的分離度。二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮與萘普生獲得較好分離效果所需的工作電壓分別為13、12、14、14 kV。

表1 不同分離電壓下4種外消旋體的拆分結(jié)果Table 1 Separation results of the four racemates at different separation voltages

2.5.2緩沖液濃度對手性化合物拆分的影響

在最優(yōu)分離電壓條件下,采用pH值為3.51但濃度不同的緩沖溶液,4種外消旋體的色譜拆分情況如表2所示。當(dāng)分離二氫黃酮時(shí),緩沖溶液濃度由0.050 mol/L升至0.075 mol/L,其分離度增大;繼續(xù)增至0.125 mol/L,分離度卻一直降低。當(dāng)緩沖溶液濃度為0.05 mol/L時(shí),3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺和吡喹酮都無法分開,繼續(xù)由0.075 mol/L增至0.100 mol/L時(shí),3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮的分離度都增大,但是當(dāng)濃度升至0.125 mol/L時(shí),二者分離度都降低。當(dāng)緩沖溶液濃度由0.050 mol/L增至0.100 mol/L時(shí),萘普生的分離度逐漸增大,繼續(xù)增至0.125 mol/L時(shí),萘普生則無法分開。因此,適當(dāng)范圍內(nèi)增加緩沖溶液的濃度可以提高手性分離效果,但過高濃度不但會降低拆分效率,還會導(dǎo)致不能手性分離。二氫黃酮得到較好分離的緩沖溶液濃度是0.075 mol/L,其他3種皆是0.100 mol/L。

表2 不同濃度的緩沖溶液下4種外消旋體的拆分結(jié)果Table 2 Separation results of the four racemates at different concentrations of buffer solution

2.5.3緩沖液pH值對手性化合物拆分的影響

在優(yōu)化后的分離電壓和緩沖液濃度下,考察實(shí)驗(yàn)緩沖溶液pH值對外消旋體分離的影響,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。當(dāng)pH值從2.48增加到3.51,二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮分離度隨之增大;當(dāng)pH值增加到4.50時(shí),分離度反而降低。萘普生pH值為3.51時(shí),其分離度為3.59,但隨著pH值的升高,反而無法將其分開。太低的pH值能影響色譜固定相的活性,太高的pH值能增大電滲流,縮短分析物的保留時(shí)間,影響分析物的拆分效果。拆分4種手性物質(zhì)的最佳pH值均為3.51。

表3 不同pH值緩沖溶液下4種外消旋體的拆分結(jié)果Table 3 Separation results of the four racemates at different pH values of buffer solution

經(jīng)過上述3個實(shí)驗(yàn)的研究探討,得到4種手性物質(zhì)在最佳拆分條件的電色譜圖(見圖6),二氫黃酮、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、吡喹酮與萘普生它們的分離度分別是2.99、2.10、2.58、3.59,全部都達(dá)到了基線分離,表明POCs手性色譜柱對外消旋體具有良好的手性識別能力和分離效果。

圖6 POCs手性柱對4種外消旋體的電色譜圖Fig.6 Electrochromatograms of the four racemates on POCs chiral columns

2.6 POCs色譜柱對位置異構(gòu)體的拆分

POCs毛細(xì)管柱對位置異構(gòu)體o,m,p-碘苯胺、o,m,p-硝基苯胺也進(jìn)行了分離研究(見圖7)。電色譜分離介質(zhì)為0.100 mol/L、pH 3.51的Tris-H3PO4緩沖溶液,分離電壓為15 kV。位置異構(gòu)體與POCs固定相間存在著相互作用力,因位置異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)、大小各不相同,與固定相接觸時(shí)產(chǎn)生的效果存在差異,在苯系位置異構(gòu)體中,其鄰、間、對位的長寬比不一樣,與固定相的作用力大小也不一樣,其保留時(shí)間不同,從而使位置異構(gòu)體分離。

圖7 POCs手性柱對(a)o,m,p-硝基苯胺和(b)o,m,p-碘苯胺的分離電色譜圖Fig.7 Electrochromatograms of (a)o,m,p-nitroaniline and (b)o,m,p-iodoaniline on POCs chiral columns

3 結(jié)論

將手性POCs用作毛細(xì)管電色譜固定相,能對二氫黃酮、吡喹酮、萘普生、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺手性化合物進(jìn)行基線分離,對o,m,p-硝基苯胺、o,m,p-碘苯胺位置異構(gòu)體具有良好的分離效果。該研究表明,手性POCs是一類很有發(fā)展?jié)摿Φ氖中苑蛛x材料,對該類材料的深入研究,必將推進(jìn)手性識別材料的發(fā)展,拓展毛細(xì)管電色譜在手性分離領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。