趙莎莎 石麗君 吳 迎

（北京體育大學運動人體科學學院，北京100084）

骨骼肌、血管內(nèi)皮及胃腸道上皮等細胞質(zhì)膜在生理情況下處于“損傷”和“修復”的動態(tài)平衡中。胞膜損傷的誘因包括細胞內(nèi)外滲透壓改變、細菌毒素打孔、寄生蟲感染、機械外力改變和缺血應激等［1］。細胞膜修復（plasma membrane repair，PMR）延遲或受阻可能導致膜的損傷與修復失衡，誘發(fā)一系列生理或病理變化。如血管內(nèi)皮細胞膜的損傷可致動脈粥樣硬化，胃腸道黏膜上皮受損可引起胃潰瘍的發(fā)生，覆蓋皮膚表層的復層上皮細胞膜破壞可誘發(fā)疤痕產(chǎn)生等［2］。此外，當人體進行高強度或不習慣的運動后（如離心運動），骨骼肌細胞膜將發(fā)生明顯破損。研究表明，細胞會在機械刺激或化學應激下誘發(fā)細胞膜損傷，如不及時進行修復將導致細胞“死亡”。相反，有效的PMR能夠及時關閉細胞的“大門”，防止胞內(nèi)成分的外流及胞外大量離子、氧化劑進入，從而維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，確保細胞存活［3］。細胞膜的修復是一項復雜的“工程”，許多膜修復蛋白協(xié)同參與其中，并依據(jù)損傷的特點遵守時序性完成修復，其機制目前尚未完全清晰。

實驗技術(shù)及膜修復的快速動態(tài)變化是限制膜修復研究開展的最大障礙，但隨著活細胞成像技術(shù)的不斷發(fā)展，這一復雜過程的“神秘面紗”逐漸被揭開。目前研究發(fā)現(xiàn)的參與PMR 的蛋白質(zhì)包括肌營養(yǎng)不良蛋白（dysferlin）、膜聯(lián)蛋白（annexins）、MG53 （mitsugumin 53）、小窩蛋白（caveolin）、鈣激活蛋白酶（calpains）、 突觸結(jié)合蛋白（synaptotagmin，Syt）、可溶性-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptors，SNAREs）等［1，4］。近年來，與晚期內(nèi)吞體形成途徑有關的轉(zhuǎn)運必需內(nèi)體分選復合體（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系統(tǒng)被認為是打開PMR“黑箱”的關鍵鑰匙。2014年，Jimenez 等［5］證實了ESCRT 系統(tǒng)在質(zhì)膜小傷口修復過程中的重要作用。隨后，Scheffer等［6］又驗證了其在質(zhì)膜大傷口快速修復中的作用機制?；诖?，ESCRT 系統(tǒng)是目前探究到的為數(shù)不多的既能調(diào)控小傷口“縫合”，也能介導大傷口“封印”的重要修復系統(tǒng)。

本文綜述了ESCRT 系統(tǒng)介導的以胞外出芽和多囊泡體（multivesicular body，MVB）形成為核心的兩種修復方式，梳理了ESCRT 系統(tǒng)各亞復合體在質(zhì)膜損傷修復中的重要作用，旨在為細胞膜損傷修復提供新的研究思路和防治策略。

1 ESCRT系統(tǒng)的組成及其生理學功能

ESCRT 系統(tǒng)廣泛存在于人體的多種組織細胞中，如肌組織、神經(jīng)組織、上皮組織等，并參與胞質(zhì)分裂、病毒出芽、細胞凋亡、細胞自噬、蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、PMR 及核膜重塑等重要生命過程［5-14］。ESCRT 系統(tǒng)由6 個亞復合體組成，包括

ESCRT-0、 ESCRT-Ⅰ、 ESCRT-ⅠⅠ、 ESCRT-ⅠⅠⅠ、Vps4-Vta1 和ALⅠX 二 聚 體［15］。以 酵 母 為 例，ESCRT系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。ESCRT系統(tǒng)的6個亞復合體都由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物構(gòu)成，不同復合體的亞基雖結(jié)構(gòu)各異，但不同亞基經(jīng)特定結(jié)構(gòu)域相互聯(lián)系作為功能復合體共同發(fā)揮作用。人類與酵母的ESCRT 系統(tǒng)同源性較高，發(fā)揮其特異性作用的結(jié)構(gòu)域或基序相似［15-16］。酵母與人類ESCRT 命名法的轉(zhuǎn)換，各組成部分的功能序列及作用見表1［16-42］。ESCRT 的發(fā)現(xiàn)與人們對MVB 的研究密切相關。 MVB 中的內(nèi)腔囊泡（intraluminal vesicles，ⅠLVs）在ESCRT 的作用下對“貨物”蛋白進行分揀，最后由晚期內(nèi)吞體的限制膜向腔內(nèi)出芽而成。這些ESCRT 蛋白能夠按照順序依次被招募至內(nèi)吞體膜上協(xié)同形成ⅠLVs。

Fig.1 Basic structure of the ESCRT system圖1 ESCRT系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

Table 1 ESCRT system composition，naming，functional domain，motif and function表1 ESCRT系統(tǒng)的組成、命名、功能結(jié)構(gòu)域、基序及作用

1.1 ESCRT-0

ESCRT-0的主要功能是識別泛素化蛋白并富集底物。除此以外，ESCRT-0 還具有招募網(wǎng)格蛋白（包涵素）、泛素化連接酶及去泛素化酶的作用。ESCRT-0 由亞基Vps27/HRS 和Hse1/STAM 以1∶1比例構(gòu)成［18-19］。Vps27 和Hse1 的N 端都包含了能與泛素結(jié)合的VHS 結(jié)構(gòu)域［20］。Vps27 的VHS 結(jié)構(gòu)域下游緊跟一個FYVE結(jié)構(gòu)域，Vps27和HRS可通過FYVE結(jié)構(gòu)域與早期內(nèi)吞體膜的磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinosito-3-phosphate，PⅠ3P）結(jié)合，從而介導膜定位［21-22］。FYVE結(jié)構(gòu)域的下游是泛素結(jié) 合 結(jié) 構(gòu) 域（ubiquitin-binding motif， UⅠM），ESCRT-0的多個泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域使其對多聚泛素化鏈具有很高的親和力，并對泛素化標記的“貨物”蛋白有聚集作用。包涵素通過與HRS 的包涵素結(jié)合（clathrin-binding， CB） 結(jié) 構(gòu) 域 相 連， 同ESCRT-0一起被招募，以促進ESCRT-0在電子致密微域中的聚集［23］。Vps27 則通過P（S/T）XP 基序與ESCRT-Ⅰ的Vps23亞基結(jié)合［24-26］，并將后者招募至內(nèi)體膜上。ESCRT-0 通過VHS、UⅠM 結(jié)構(gòu)域與泛素結(jié)合從而識別標記目的蛋白，是MVB 路徑中募集靶蛋白的關鍵步驟。

1.2 ESCRT-I和ESCRT-II

ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ功能相似，通常協(xié)同發(fā)揮作用。ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ以1∶1 的比例在膜上組裝，其主要功能是使內(nèi)體膜內(nèi)陷形成初始芽體［27-28］。ESCRT-Ⅰ由亞基Vps23/TSG101、Vps28/VPS28、Vps37/VPS37 和Mvb12/MVB12 組 成，亞基Vps22/EPA30、Vps25/EPA20 和Vps36/EPA45 則構(gòu)成了ESCRT-ⅠⅠ［29-31］。其中，ESCRT-Ⅰ亞基Vps23的N 端有一個UEV（ubiquitin E2 variant）結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合泛素化蛋白和某些病毒蛋白；Vps28 的C端有一個四螺旋結(jié)構(gòu)CTD，主要負責招募ESCRT-ⅠⅠ；Vps37 的N 端結(jié)構(gòu)域能夠幫助ESCRT-Ⅰ與膜結(jié)合。Vps22 與ESCRT-Ⅰ的Vps37 功能類似，有助于ESCRT-ⅠⅠ的膜定位。ESCRT-ⅠⅠ亞基Vps25 包含的WH （winged-helix） 結(jié) 構(gòu) 域 能 與ESCRT-ⅠⅠⅠ亞 基Vps20 結(jié)合；Vps36 包含一個GLUE 結(jié)構(gòu)域，能與PⅠ3P 結(jié)合介導其定位［15］。另外，ESCRT-Ⅰ可通過Vps23 的UEV 結(jié)構(gòu)域與ESCRT-0 相互作用，而ESCRT-ⅠⅠ則 通 過WH 結(jié) 構(gòu) 域 與ESCRT-ⅠⅠⅠ連接［24-26，32］。 ESCRT-Ⅰ 和 ESCRT-ⅠⅠ 通 過 CTD（Vps28）-GLUE（Vps36）結(jié)構(gòu)域相連接，共同驅(qū)動MVB的形成，分揀“貨物”蛋白［16］。

1.3 ESCRT-III

ESCRT-ⅠⅠⅠ的主要功能是剪切芽頸、生成小泡，其在ESCRT 系統(tǒng)介導膜剪切中發(fā)揮了核心作用［33］。ESCRT-ⅠⅠⅠ由 亞 基Vps2/CHMP2、Vps20/CHMP6、 Vps24/CHMP3、 Snf7/CHMP4、 Vps60/CHMP5、Did2/CHMP1 和Ⅰst1/ⅠST1 組 成［15，27，33］。與ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-ⅠⅠ亞復合體不同，ESCRT-ⅠⅠⅠ亞復合體以單體形式存在于細胞基質(zhì)中，只有當這些亞基在內(nèi)體膜上有序組裝時才能發(fā)揮其蛋白分揀轉(zhuǎn)運功能。其中，Vps2、Vps20、Vps24和Snf7 是行使復合體剪切功能的核心亞基，而Vps60、Did2和Ⅰst1并不是ESCRT-ⅠⅠⅠ發(fā)揮功能所必需的［15-16］。ESCRT-ⅠⅠⅠ按Vps20-Snf7-Vps24-Vps2順序進行組裝。Vps20是組裝的起點，隨后Snf7介導多聚化形成絲狀、環(huán)狀或螺旋狀結(jié)構(gòu)剪切芽莖，Vps24 終止Snf7 多聚化，Vps2 招募ATP 酶Vps4，Did2 招募Vta1 或Ⅰst1［34-36］。ESCRT-ⅠⅠⅠ不僅可以通過特定區(qū)域與ESCRT-ⅠⅠ結(jié)合，而且其不同亞基通過MⅠM 基序（MⅠT interacting motif）能與Vps4 等含有MⅠT（microtubule interacting and transport）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合［32］。在水解ATP 提供能量時，Vps4 可能與ESCRT-ⅠⅠⅠ協(xié)同作用。ESCRT-ⅠⅠⅠ剪切功能的正常執(zhí)行依賴于各亞基的多聚化組裝［15］。

1.4 Vps4-Vta1

Vps4-Vta1 的主要功能是調(diào)控ESCRT-ⅠⅠⅠ的解離以維持ESCRT 系統(tǒng)的正常功能。Vps4 屬于AAA+ATP 酶 （ATPases associated with diverse cellular activities），其主要功能是水解ATP 提供能量，將內(nèi)體膜上的ESCRT-Ⅲ亞復合體解聚下來，從而完成循環(huán)利用［15，37-39］。其中，Vps4 由1 個N端結(jié)合ESCRT-ⅠⅠⅠ的MⅠT 結(jié)構(gòu)域、1 個大的ATPase結(jié)構(gòu)域、1個小的ATPase結(jié)構(gòu)域、1個β結(jié)構(gòu)域和1個C端螺旋組成［37］。Vta1結(jié)合在Vps4上，促進了Vps4 的聚合、催化活性以及與ESCRT-ⅠⅠⅠ的結(jié)合［40］。Vta1 的N 端包含了兩個序列不同的MⅠT 結(jié)構(gòu)域，通過MⅠT 結(jié)構(gòu)域既能與Did2 結(jié)合來介導Vta1 的膜定位，又能與Vps60 緊密結(jié)合相互作用。Vta1的C端VSL結(jié)構(gòu)域能與Vps4的β結(jié)構(gòu)域結(jié)合。雖然Vta1與Vps4在晶體結(jié)構(gòu)上并不像其他ESCRT復合體亞基之間一樣組合相連，但Vta1 與Vps4 在功能上以復合體的形式發(fā)揮作用。Vps4-Vta1 共同作用于MVB途徑和其他Vps4參與的生命過程［41］。Vta1 與Vps4、ESCRT-ⅠⅠⅠ結(jié)合并能促進Vps4 的多聚化、激活ATP酶活性，是Vps4的組裝因子。

1.5 ALIX

活化的ALⅠX 形成二聚體發(fā)揮作用，其通過Bro1 結(jié)構(gòu)域與Snf7 結(jié)合以穩(wěn)固Snf7 多聚體，并參與招募去泛素化酶Doa4，也可作為適配器連接ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠⅠ［15］。除此之外，ALⅠX還能激活ESCRT-ⅠⅠⅠ的組裝，調(diào)控ESCRT-ⅠⅠⅠ的功能，從而作為功能復合體參與PMR［42-44］。

2 ESCRT系統(tǒng)在PMR中的作用

大多數(shù)研究學者認為，細胞膜主要有三種修復模式：胞吞、胞外出芽和膜“補丁”［5］。細胞膜受損時細胞采用何種修復模式取決于“傷害”的性質(zhì)和“傷口”的大小。如造孔毒素（pore-forming toxins，PFTs） 誘導的“傷口”較?。ㄖ睆剑?00 nm），且它們形成的蛋白質(zhì)孔不能通過脂質(zhì)補丁修補，所以多采用胞吞和胞外出芽的方式修復；而大傷口（直徑200～500 nm）則主要采用膜“補丁”進行修復［1，45-48］。ESCRT 系統(tǒng)可同時參與大傷口和小傷口的修復，但目前對于大傷口修復的研究較少［5-6］。根據(jù)ESCRT系統(tǒng)介導修復模式的不同，可將其分為胞外出芽和MVB 形成兩種修復途徑。

2.1 ESCRT系統(tǒng)與出芽修復

胞外出芽修復依賴于ESCRT 系統(tǒng)。激光誘導的HeLa 細胞膜損傷實驗中，活細胞成像觀察發(fā)現(xiàn)了膜傷口處ESCRT 系統(tǒng)相關蛋白招募，其中包括ESCRT-ⅠⅠⅠ 的 CHMP4B、 CHMP3、 CHMP2A、CHMP2B 亞基和VPS4。在此基礎上，Jimenez等［5］進一步研究證實了CHMP4B 在該修復方式中發(fā)揮了關鍵作用。掃描電子顯微鏡觀察可見，損傷區(qū)域附近帶有CHMP4B 熒光標記的細胞外芽，用siRNA-CHMP4B 技術(shù)處理損傷細胞后發(fā)現(xiàn)細胞存活率顯著下降，證實ESCRT-ⅠⅠⅠ可通過出芽的方式參與PMR［5］。隨后在其他研究中又陸續(xù)驗證了Ca2+、Annexin A7和ALG-2（apoptosis link protein）是ESCRT 系統(tǒng)介導出芽修復的重要參與者，ESCRT系統(tǒng)介導的出芽修復機制如圖2所示。

2.1.1 Ca2+觸發(fā)ESCRT系統(tǒng)相關蛋白的順序性裝配

Ca2+是啟動ESCRT系統(tǒng)介導出芽式修復的“鑰匙”。Scheffer等［6］證實只有當細胞內(nèi)Ca2+增多時，細胞膜表面的ALⅠX、ALG-2、VPS4 和ESCRT-ⅠⅠⅠ聚集才會增強。反之，無Ca2+時未能觀察到ESCRT參與的修復發(fā)生。

ESCRT 系統(tǒng)介導的出芽修復相關蛋白的募集呈現(xiàn)出嚴格的時序性。損傷后的細胞膜表面可見修復蛋白呈現(xiàn)順序性聚集，如ALⅠX和ALG-2在損傷后30 s 內(nèi)開始組裝，CHMP1A 和CHMP4B 于損傷后45 s 開始組裝，而VPS4 則于損傷后60 s 開始組裝［6］。該修復過程中招募的鈣離子結(jié)合蛋白ALG-2已被證實以Ca2+依賴的方式與ALⅠX、TSG-101 和CHMP4B相聯(lián)系。S?nder等［44］用免疫共沉淀證明了ALG-2 與Annexin A7 以復合體的形式聚集于損傷處，ESCRT-ⅠⅠⅠ和VPS4功能的執(zhí)行依賴于ALG-2與Annexin A7 精確的膜定位。首先，Annexin A7以Ca2+和磷脂酰絲氨酸依賴的方式與游離的膜邊緣結(jié)合，并促進Ca2+與膜的結(jié)合；其次，Annexin A7在細胞膜損傷時被招募至損傷部位靶定于細胞膜，并于損傷處與具有EF-Hand結(jié)構(gòu)的鈣離子結(jié)合蛋白ALG-2結(jié)合，ALⅠX通過與ALG-2直接作用被招募至細胞膜缺口處；最后，ALG-2 與ALⅠX 組裝ESCRT-ⅠⅠⅠ亞復合體和TSG101，在傷口愈合過程中幫助切除和脫落細胞膜的受損部分［6，44，49］。綜上所述，ESCRT-ⅠⅠⅠ和VPS4 等ESCRT 系統(tǒng)相關蛋白在損傷細胞膜上的定位累積需要Annexin A7、ALG-2和ALⅠX復合體的形成，且缺一不可［44］。

Fig.2 Budding repair mediated by the ESCRT system圖2 ESCRT系統(tǒng)介導的出芽式修復

2.1.2 ESCRT-III和VPS4參與出芽小泡的形成及脫落

膜斷裂和囊泡形成是修復所必需的，ESCRT-Ⅲ和VPS4參與了出芽小泡的形成及脫落過程。行使重要修復職能的ESCRT-ⅠⅠⅠ由眾多亞基組成，這些亞基是細胞質(zhì)中不活躍的單體，當膜修復觸發(fā)后，它們能組裝成具有活性的ESCRT-ⅠⅠⅠ異型聚合物［15］。在此過程中，ESCRT-ⅠⅠⅠ一方面驅(qū)動細胞膜向胞外突出變形、剪切芽頸，促進胞外小泡（或微囊泡體）的釋放［33］，另一方面，Meng 等［50］研究發(fā)現(xiàn)ESCRT-ⅠⅠⅠ可作為上游信號招募與細胞膜修復相關的關鍵蛋白Syntaxin2 和EFF-1。VPS4 主要在水解ATP 提供能量的條件下介導ESCRT-ⅠⅠⅠ的解離。

ESCRT-ⅠⅠⅠ介導的胞外出芽式修復具有以下特點：a.ESCRT-ⅠⅠⅠ靶向細胞膜聚集不需要ATP。出芽修復過程中的關鍵亞基CHMP4B 在細胞膜中的募集不需要完全聚合的微管，不依賴于ATP。b.胞外出芽修復主要依賴于ESCRT-Ⅲ和VPS4。于“傷口”處監(jiān)測ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ，只觀察到了TSG101 在膜處的聚集［5-6］。TSG101 在適配器ALG-2 的作用下連接ALⅠX，這可能是TSG101在PMR 部位積累的基礎［49］。ALⅠX 通過特定結(jié)構(gòu)域直接與ESCRT-ⅠⅠⅠ相連接，在出芽修復中損傷誘導的ESCRT-ⅠⅠⅠ組裝繞過了ESCRT-0、Ⅰ和ⅠⅠ。c.與MVB 路徑相比，出芽修復中的泛素化反應相對滯后。MVB 途徑中“貨物”蛋白的泛素化是修復的初始過程，而出芽修復中TSG101引起的多聚泛素化反應相對延遲。與MVB 路徑不同，出芽式修復中滯后的泛素化反應主要是為了加強最初ESCRT系統(tǒng)的招募［51］。兩種修復方式中ESCRT參與工作的機制并不相同，相比之下，ESCRT 介導的MVB修復更為復雜。

2.2 ESCRT系統(tǒng)與MVB形成的修復

MVB生物發(fā)生涉及20多種囊泡分揀蛋白，其中最重要的是在內(nèi)吞體膜上聚集的ESCRT 蛋白。PMR 過程中，損傷細胞膜向內(nèi)凹陷形成約300～500 nm 大小的細胞內(nèi)吞泡，經(jīng)內(nèi)吞體途徑發(fā)展，在ESCRT 系統(tǒng)的作用下，內(nèi)吞泡融合在一起形成富含多個ⅠLVs 的MVB［16］。MVB 形成后一方面可以通過溶酶體途徑將侵害細胞膜的PFTs 或受損蛋白降解，另一方面可與細胞膜融合并胞出大量促使組織修復和再生的細胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）， 通 過 這 兩 種 途 徑 完 成PMR［45，52-55］。

2.2.1 ESCRT-0、Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ介導MVB的形成

MVB 的形成始發(fā)于細胞膜內(nèi)陷。當細胞膜受損時，胞外Ca2+向胞內(nèi)聚集，Ca2+濃度升高觸發(fā)溶酶體胞吐，溶酶體與細胞膜的融合可減輕膜張力，引起酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）釋放。鞘磷脂酶移至細胞膜表面，水解鞘磷脂磷脂酰膽堿頭部基團產(chǎn)生富含神經(jīng)酰胺的微域，隨后神經(jīng)酰胺驅(qū)動膜內(nèi)陷使受損脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等內(nèi)化形成內(nèi)吞囊泡［47，53］。這種膜響應方式作為真核生物保護自己免受細菌攻擊的早期有效方法。該過程中的內(nèi)陷囊泡也被稱為早期內(nèi)吞體，早期內(nèi)吞體是晚期內(nèi)吞體形成的基礎，MVB就是含有眾多ⅠLVs的成熟晚期內(nèi)吞體。ⅠLVs 的形成依賴于ESCRT 亞復合體蛋白，這些蛋白質(zhì)是泛素化蛋白正確分選后內(nèi)陷到MVB腔間隙囊泡中所必需的［7］。

ESCRT系統(tǒng)是MVB形成的重要參與者，其亞復合體通過特定的功能結(jié)構(gòu)域使“貨物”蛋白實現(xiàn)順序性呈遞［7，16］。首先，“貨物”蛋白被泛素化修飾?！柏浳铩钡鞍仔璞环核貥擞浐蟛拍鼙籈SCRT-0的Vps27 亞基和Hse1 亞基的VHS、UⅠM 泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別。其次，ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ及ESCRT-ⅠⅠ通過特定亞基與內(nèi)吞體膜上的特異性脂質(zhì)磷脂酰肌醇三磷酸結(jié)合，這有助于ESCRT 系統(tǒng)在內(nèi)吞體的靶向定位。ESCRT-0、Ⅰ、ⅠⅠ亞復合體按照P（S/T）XP 基序-UEV 和CTD-GLUE 的順序連接起來，隨后經(jīng)各自的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)泛素化“貨物”的順序性呈遞。最后，ESCRT-ⅠⅠⅠ通過亞基Vps25 與Vps20 之間的連接被ESCRT-ⅠⅠ招募。ESCRT-0能結(jié)合泛素連接酶和去泛素化酶協(xié)調(diào)泛素化及去泛素化過程，是簇集“貨物”蛋白的主要因子。ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ這兩種亞復合體富集于囊泡芽頸處，顯著降低了泛素化蛋白的運動性，能夠有效誘導芽體生成，啟動膜內(nèi)陷。ESCRT-ⅠⅠⅠ的組裝是按照亞基Vps20-Snf7-Vps24-Vps2 的順序依次進行，主要功能是剪切芽頸驅(qū)動囊泡的產(chǎn)生。在ESCRT 系統(tǒng)的調(diào)控下，泛素化“貨物”被分選并向內(nèi)凹陷形成囊泡釋放至內(nèi)腔中。隨著ⅠLVs 的增多，MVB逐漸形成［7，15-16，28］。

最新研究表明，哺乳動物細胞中除了典型的ESCRT-0、 ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠ依 賴 途 徑 外，ALⅠX 能繞開ESCRT-Ⅱ直接激活ESCRT-ⅠⅠⅠ，作為替代的適配器將“貨物”蛋白分選到ⅠLVs［7］?；罨腁LⅠX 形成二聚體，作為支架蛋白偶聯(lián)CHMP4，調(diào)控及穩(wěn)定CHMP4 的多聚化。ALⅠX 通過 亞 基CHMP4、 TSG101 分 別 與ESCRT-ⅠⅠⅠ、ESCRT-Ⅰ相互作用，具有連接ESCRT-Ⅰ和ESCRT-ⅠⅠⅠ的潛力。此外，Baietti 等［56］和Hurley 等［57］報道了ALⅠX 與細胞內(nèi)接合蛋白syntenin 的結(jié)合能促進MVB 來源EVs 的釋放。目前認為ALⅠX 在MVB途徑中充當“輔助角色”，但這些該研究的重要發(fā)現(xiàn)提示了ALⅠX 可能在MVB 修復中舉足輕重，這需要進一步研究證實。

2.2.2 Vps4-Vta1介導ESCRT-ⅠⅠⅠ的解聚與循環(huán)

ESCRT-ⅠⅠⅠ完成剪切后，不會進入ⅠLVs 內(nèi)部，而是留在內(nèi)體膜表面。Vps4-Vta1 亞復合體的催化作用使ESCRT-ⅠⅠⅠ各亞基發(fā)生解聚并從內(nèi)體膜釋放到細胞質(zhì)中，完成循環(huán)并作用于下一輪膜剪切。ESCRT-ⅠⅠⅠ的解聚是一個耗能過程，Vps4 水解ATP提供能量使ESCRT-ⅠⅠⅠ構(gòu)象改變，最終使其解聚。Vps4 是ESCRT 整個系統(tǒng)的反應能量來源，也是ESCRT系統(tǒng)參與的生理過程的“總開關”，其缺失將導致MVB途徑被完全阻斷［58-59］。

除此之外，MVB 途徑的正常進行需要完整的泛素化和去泛素化過程。因此，控制蛋白質(zhì)的泛素化對于ESCRT 系統(tǒng)調(diào)控的ⅠLVs“貨物”分選至關重要［60］。E3泛素連接酶和去泛素化酶是ESCRT系統(tǒng)介導的蛋白質(zhì)分選的關鍵調(diào)節(jié)因子。MVB 途徑的調(diào)控不僅是通過調(diào)節(jié)“貨物”泛素化實現(xiàn)的，而且也是通過控制ESCRT 系統(tǒng)組件（如HRS、TSG101 和ALⅠX） 的泛素化來實現(xiàn)的。Amerik等［61］在萌芽酵母實驗中證實，“貨物”去泛素化發(fā)生在ⅠLVs分選之前。“貨物”蛋白被泛素化修飾以進入MVB 途徑進行分揀，并在進入MVB 囊泡之前及時去掉泛素分子，這對于維持細胞內(nèi)泛素的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

2.2.3 MVB發(fā)展路徑與PMR

MVB 形成后可通過兩種不同的發(fā)展路徑促進PMR，即通過溶酶體途徑直接將內(nèi)含物降解和驅(qū)動MVB同細胞膜融合釋放ⅠLVs。MVB中的PFTs、膜表面蛋白及膜脂質(zhì)等可趨向溶酶體降解。Corrotte 等［45］已證實，內(nèi)吞毒素以MVB 的形式趨向溶酶體降解。PFTs 或受損膜蛋白的內(nèi)吞清除過程包括溶酶體的胞吐和窖體的內(nèi)吞，以及ESCRT系統(tǒng)介導的ⅠLVs 在晚期內(nèi)吞體內(nèi)的萌發(fā)?！柏浳铩北环核鼗揎椇蠓诌x進入MVB，最后通過溶酶體途徑在酸性環(huán)境中將囊泡中的“貨物”蛋白進行降解。雖然ⅠLVs 中的“貨物”主要靶向至溶酶體，但一些ⅠLVs 及其“貨物”并不一定要降解。MVB經(jīng)胞吐釋放出傳遞細胞外信號的ⅠLVs，這些ⅠLVs也是一種EV。大量研究發(fā)現(xiàn)細胞間存有眾多來源于MVB 的EVs［62］。PMR 過程中，SNARE 蛋白和眾多束縛因子，如突觸關聯(lián)蛋白（SNAP23）、突觸融合蛋白1a（Syntaxin1a）、囊泡相關膜蛋白7（vesicle-associated membrane protein 7，VAMP7）、VAMP8、Rabs11、Rabs27 和Rabs35 等協(xié)同作用，促使MVB 趨向細胞膜進行胞吐，并在胞外分泌時釋放ⅠLVs［53］。通過囊泡運輸，受損的細胞膜一般可在損傷后幾分鐘內(nèi)完成修復。但當質(zhì)膜受損嚴重時，EVs 釋放的細胞外信號將調(diào)控修復過程持續(xù)進行。

ESCRT系統(tǒng)介導的胞外出芽和以MVB形成為核心的兩種修復途徑既有區(qū)別又有聯(lián)系。它們的共通點是在修復過程中都有EVs產(chǎn)生，不同點是這兩種修復方式所產(chǎn)生的EVs 大小、組成和來源不同。例如，出芽小泡的直徑約在150～1 000 nm，而ⅠLVs 直徑約在30～150 nm。Roefs 等［54］和Cabral等［55］認為，EVs 能夠以旁分泌或內(nèi)分泌的方式促進組織修復和創(chuàng)面愈合。此外，Bittel等［53］報道出芽和MVB 兩種途徑產(chǎn)生的EVs 均可參與骨骼肌細胞膜損傷修復。骨骼肌作為人體運動的主要功能器官，細胞膜的損傷較為常見。大強度運動或離心收縮后骨骼肌最明顯的損傷就是細胞膜通透性提高，若能促進骨骼肌運動后細胞膜的損傷修復，將有利于骨骼肌疲勞的恢復加速，改善運動疲勞恢復效率?；诖?，深入研究ESCRT系統(tǒng)在PMR中的作用，將有助于探尋促進骨骼肌細胞膜損傷修復的新方法，為促進運動骨骼肌疲勞恢復提供新思路。

3 ESCRT系統(tǒng)膜修復異常與疾病

細胞膜破損出現(xiàn)“傷口”是程序性壞死、細胞焦亡及鐵死亡等細胞壞死的主要誘因［63］。一方面，經(jīng)“傷口”釋放的細胞因子能夠誘導細胞裂解并刺激機體進行免疫應答，而這與癌癥、敗血癥和神經(jīng)退行性疾病等密切相關。另一方面，ESCRT 系統(tǒng)及時、有效地修復可延緩細胞“死亡”，成為相關疾病治療的新靶點［64-67］。

ESCRT 系統(tǒng)的膜修復功能為治療癌癥提供了新思路。大量研究證實，ESCRT-Ⅲ亞復合體通過修復受損的細胞膜能抑制程序性壞死、細胞焦亡及鐵死亡［64-66］。ESCRT-Ⅲ亞基CHMP4B 在這三個不同的調(diào)控細胞“死亡”途徑中具有共同作用，即抗衡膜穿孔和延遲細胞“死亡”，這為細胞存活爭取了寶貴時間，受損細胞得以釋放特異性細胞因子向鄰近細胞發(fā)出危險信號。ESCRT-Ⅲ的“拯救”機制有可能延長被病毒感染的細胞壽命，降低氧氣缺乏導致的移植損傷及減輕心臟病或中風引發(fā)的組織缺血損傷等［66］。但是，壞死過程中與膜結(jié)合的死亡執(zhí)行因子（如MLKL、焦孔素（gasdermins）、脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxides））濃度過高時，細胞的修復機制不堪重負，也會導致膜破裂和“死亡”。Liu 等［68］認為負調(diào)控依賴于ESCRT-Ⅲ的膜修復功能促進細胞的非凋亡性死亡，這在一定程度上能夠提高抗癌劑對腫瘤細胞“死亡”的敏感性，可作為治療腫瘤的潛在靶點。

ESCRT 系統(tǒng)的膜修復功能為治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）提供了新的可能。β 淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）異常沉積是AD發(fā)病的關鍵，與神經(jīng)細胞的氧化損傷、突觸功能紊亂、細胞內(nèi)鈣離子失調(diào)及神經(jīng)細胞凋亡等有關［69］。所以，降低Aβ含量及減弱其神經(jīng)毒性作用是延緩AD 進程、減輕AD 癥狀的關鍵。ESCRT 系統(tǒng)通過胞外出芽和MVB 途徑共同調(diào)控Aβ 毒性［67，70-71］。例如，F(xiàn)ruhmann 等［67］敲除Bro1 基因證實了ESCRT系統(tǒng)可通過增強膜修復功能下調(diào)Aβ毒性。此外，溶酶體膜、核膜等的修復也是由ESCRT 系統(tǒng)介導的。溶酶體膜修復時，ESCRT-ⅠⅠⅠ依賴TSG101 和ALⅠX 被招募至傷口處［72］；核膜修復過程中，CHMP4B 被ESCRT-Ⅲ附屬蛋白CHMP7 及核膜內(nèi)層蛋白LEMD2 招募至損傷部位發(fā)揮作用［73］。

ESCRT 系統(tǒng)為肌肉損傷或肌營養(yǎng)不良患者提供了潛在的治療靶點。當骨骼肌受到機械刺激，或因遺傳性疾?。ㄈ缂I養(yǎng)不良）使肌纖維脆性增加時，膜損傷更容易發(fā)生。肌纖維修復主要依賴于胞內(nèi)修復蛋白如dysferlin、annexins 和ESCRT 系統(tǒng)等，而再生則側(cè)重依賴于ESCRT 系統(tǒng)和激活衛(wèi)星細 胞（satellite cells，SCs） 增 殖 分 化 的EVs。Scheffer等［6］已證實，在肌細胞質(zhì)膜大面積局灶性損傷中，ESCRT 系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用，若其功能喪失將會抑制受損質(zhì)膜出芽形成EVs，最終影響修復完成。Le Bihan 等［74］認為，EVs 不僅可以作為監(jiān)測先天性肌病進展的生物標志物，而且能夠有效協(xié)調(diào)細胞內(nèi)和細胞間的信號交流，增強修復效應，改善先天性肌病。Koutsoulidou 等［75］研究表明，EVs 在1 型肌強直性營養(yǎng)不良（myotonic dystrophy type 1，DM1）中發(fā)揮作用。ESCRT系統(tǒng)對EVs的產(chǎn)生和調(diào)控是至關重要的，因此，在未來有關EVs引起的疾病可考慮以ESCRT 系統(tǒng)為落腳點，可能會實現(xiàn)新的突破。

4 總結(jié)與展望

ESCRT 系統(tǒng)是PMR 近年來的研究熱點。深入探究ESCRT 系統(tǒng)的修復機制，能夠為有效干預細胞膜損傷修復提供幫助。以ESCRT 系統(tǒng)為靶點完善或加速PMR 過程，可為機械損傷或化學應激引起的細胞膜損傷修復提供新方法。例如，ESCRT系統(tǒng)的PMR 機制為運動骨骼肌的加速恢復提供了潛在可能。如何加速骨骼肌在延遲性肌肉酸痛（delayed onset muscle damage，DOMS）期的恢復是提高運動訓練效率的重要問題，通過加速細胞膜“傷口”的封印，將有效防止肌細胞胞內(nèi)成分的外流和胞外大量離子、氧化劑進入，從源頭加快骨骼肌損傷修復和運動疲勞的消除。ESCRT 系統(tǒng)可能在運動或遺傳性缺陷引起的肌肉損傷修復和再生中發(fā)揮重要作用。因此，外源性ESCRT 重組蛋白手段干預促進ESCRT 系統(tǒng)修復可能成為骨骼肌、血管內(nèi)皮及神經(jīng)元損傷修復的治療靶點之一。

與其他膜修復蛋白相比，ESCRT 系統(tǒng)的修復過程更為復雜，其機制遠未明了。例如：胞外出芽和MVB 形成兩種修復方式的觸發(fā)順序、時程特點尚未完全清晰；ALⅠX如何激活ESCRT-Ⅲ也未見報道；Vps4十二聚體是如何撬動ESCRT-ⅠⅠⅠ亞復合體以實現(xiàn)解聚反應目前難以闡明；ESCRT 可調(diào)控信號轉(zhuǎn)導，其介導PMR的信號轉(zhuǎn)導機制還有待探討。PMR精密且復雜，“修補匠們”各司其職共同完成修復，ESCRT 與其他膜修復蛋白是如何協(xié)同工作的，是否相互影響？在膜修復不同模型中其又有哪些特點？如“修復帽”模型中ESCRT 系統(tǒng)是否參與？這些都是今后研究ESCRT 膜修復中需要解決的問題。