危 瑩 張小丹 胡苗苗 吳忠琴 程 酩 郭 妍*

（上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海200240）

細(xì)胞作為機(jī)體的基本單元，在特定的空間位置與微環(huán)境協(xié)同，發(fā)揮其特有的生物學(xué)功能。生物學(xué)研究的重要目標(biāo)是理解正常和病理狀態(tài)下細(xì)胞的特點(diǎn)和功能。近十幾年轉(zhuǎn)錄組技術(shù)飛速發(fā)展，已可從全基因組尺度對基因表達(dá)進(jìn)行定量測量，極大地推進(jìn)了研究人員對細(xì)胞功能的理解。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展主要經(jīng)歷了三個重要的階段。第一個階段是對大量 混 合 細(xì) 胞 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 （bulk transcriptome）［1］，該方法獲得的是大量細(xì)胞的基因平均表達(dá)水平，雖然推進(jìn)了對細(xì)胞群體的特性認(rèn)識，但無法獲知群體內(nèi)特定細(xì)胞的基因表達(dá)情況。第二個階段是對單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（single cell transcriptome），該方法將對細(xì)胞基因表達(dá)的認(rèn)識推進(jìn)到單細(xì)胞的層面，目前已在發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞類型、揭示細(xì)胞異質(zhì)性等方面展現(xiàn)出優(yōu)勢。但是目前的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法仍存在一定局限性，由于單細(xì)胞懸液的獲得需要對組織進(jìn)行酶解，懸液中的單細(xì)胞失去了組織空間位置信息，而且已有研究表明，有些單細(xì)胞在酶解過程中或離開特定微環(huán)境后，基因表達(dá)譜會發(fā)生變化［2］。除此以外，某些特殊形態(tài)的細(xì)胞，如大腦中結(jié)構(gòu)復(fù)雜的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，難以通過組織酶解獲取。近年來，轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)入空間轉(zhuǎn)錄組（spatial transcriptome）階段，該技術(shù)可以同時獲得細(xì)胞的空間位置信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步推進(jìn)了對組織原位細(xì)胞真實(shí)基因表達(dá)的研究，為組織細(xì)胞功能、微環(huán)境互作、發(fā)育過程譜系追蹤、疾病病理學(xué)等多個領(lǐng)域提供了重要的研究手段。多種新的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)得到快速發(fā)展，成為生物技術(shù)研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)，本文就近年來空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展

1.1 基于原位雜交的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

1.1.1 單分子熒光原位雜交（smFISH）

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)最早可追溯到單分子熒光原位雜 交 （single molecule fluorescencein situhybridization，smFⅠSH）技術(shù)［3］。原位雜交技術(shù)于1960 年代產(chǎn)生，Gall 等［4］將細(xì)胞經(jīng)過堿處理使得DNA變性，而后與放射性同位素標(biāo)記的RNA探針一同孵育，利用放射自顯影技術(shù)檢測了青蛙卵母細(xì)胞中高度擴(kuò)增的核糖體DNA。隨后，Bauman等［5］于1980 年將3'端帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記的RNA 用作特定DNA 序列的探針，首次實(shí)現(xiàn)了熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ⅠSH）技術(shù)的應(yīng)用。FⅠSH 對識別目標(biāo)DNA 或RNA 具有高分辨率、高靈敏度和高特異性等特點(diǎn)，可直接應(yīng)用于中期染色體和間期細(xì)胞核的目標(biāo)序列檢測［6-7］。除此以外，F(xiàn)ⅠSH 還可以在單細(xì)胞水平上根據(jù)可視化的雜交信號區(qū)分不同的轉(zhuǎn)錄本［8］。1998年，F(xiàn)emino等［9］將數(shù)字成像顯微鏡應(yīng)用于FⅠSH，并且合成了帶有5個熒光基團(tuán)的寡核苷酸探針，校準(zhǔn)了單個探針發(fā)出的光，使得檢測單個RNA分子成為可能。smFⅠSH一般通過多個標(biāo)記有熒光團(tuán)的20 bp 短寡核苷酸探針來進(jìn)行（通常每個探針都標(biāo)記有一個熒光團(tuán)），這些熒光探針在組織原位與特定的mRNA 進(jìn)行特異性雜交（圖1a），以此反映細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本豐度并同時進(jìn)行空間定位［10］。

1.1.2 組合標(biāo)記

由于smFⅠSH 能夠同時使用的熒光團(tuán)種類有限，一次識別的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量很少，通常為3或4個，因此smFⅠSH 還不能實(shí)現(xiàn)基因組范圍的大通量分析［4］。2002年，Levsky等［11］發(fā)現(xiàn)可以使用組合標(biāo)記來增加可識別的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，并且可以減少單色假陽性信號的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中，通過將探針用不同條形碼（barcode）標(biāo)記來進(jìn)行分組，分別與4個熒光基團(tuán)相結(jié)合，在顯微鏡下識別熒光團(tuán)的顏色。之后通過檢測算法進(jìn)行圖像處理，根據(jù)所識別的不同顏色下的像素點(diǎn)的強(qiáng)度，分析出該位點(diǎn)是哪些顏色的結(jié)合，以此分析出不同的轉(zhuǎn)錄本。當(dāng)使用的熒光基團(tuán)的種類為n時，可鑒定的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量為2n-1個。Jakt 等［12］將組合標(biāo)記方法應(yīng)用到體外分化的小鼠胚胎干細(xì)胞中，結(jié)果表明組合標(biāo)記可定量單個細(xì)胞的多個轉(zhuǎn)錄本，還可以追蹤細(xì)胞分化過程中細(xì)胞身份的變化。雖然組合標(biāo)記方法增加了轉(zhuǎn)錄本的檢測數(shù)量，但是對于基因組范圍的分析還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，而且由于受到組織自發(fā)熒光的影響，組合標(biāo)記的方法應(yīng)用于組織切片還有一定的困難。

2012年，Lubeck等［13］通過結(jié)合超分辨顯微鏡（super-resolution microscopy，SRM）和組合標(biāo)記，識別單個mRNA 上不同熒光寡核苷酸探針的空間排序，大幅提高了檢測的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。SRM 的分辨率高達(dá)10～20 nm，20 個寡核苷酸探針長度約為7 nm，轉(zhuǎn)錄本長度約為100 nm，在SRM 下可以看到不同熒光寡核苷酸探針的空間排序，因此可解析出某個感興趣的mRNA 分子的序列。在SRM 的幫助下，可以根據(jù)不同顏色熒光團(tuán)的排列組合來區(qū)分轉(zhuǎn)錄本，例如某紅、黃、藍(lán)順序的轉(zhuǎn)錄本與藍(lán)、黃、紅順序的轉(zhuǎn)錄本是不同的轉(zhuǎn)錄本（圖1b），因此在可使用的熒光團(tuán)數(shù)量有限的情況下，可以通過不同的熒光團(tuán)順序來鑒定多個轉(zhuǎn)錄本。

1.1.3 順序雜交

雖然組合標(biāo)記增加了可識別的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，但是還無法檢測全基因組的轉(zhuǎn)錄本。2014 年，Lubeck等［14］開發(fā)了順序雜交技術(shù)。由于固定的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本的位置不會發(fā)生改變，即使通過多輪雜交，相同的熒光點(diǎn)還是可以保留在原位，所以能通過順序雜交進(jìn)行單細(xì)胞原位的RNA 分析。該技術(shù)在每一輪雜交中，使用一組標(biāo)記了單一類型熒光團(tuán)的探針，結(jié)合轉(zhuǎn)錄本后進(jìn)行成像。之后用DNA 酶處理，清除雜交鏈上結(jié)合的探針，再將轉(zhuǎn)錄本與另一組不同熒光染料標(biāo)記的、但序列相同的探針雜交（圖1c）。理論上，這種方法可以檢測Fn個不同的轉(zhuǎn)錄本（F=熒光團(tuán)數(shù)量，n=雜交回合）［15］。因此，原則上，4 種熒光染料和8 個雜交回合可以檢測一個細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄本。這種方法的好處在于即使只有2種熒光染料，也可以通過多次雜交使得檢測規(guī)模迅速擴(kuò)大。但是，如果想要將這種方法的應(yīng)用范圍擴(kuò)大到整個轉(zhuǎn)錄組，價格較昂貴。除此以外，雖然順序雜交可檢測的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量隨雜交回合的增加而呈指數(shù)增長，但同時檢測誤差也呈指數(shù)增長。

1.1.4 MERFISH

為了克服檢測誤差，2015年，Chen等［16］開發(fā)了一種名為多重錯誤魯棒熒光原位雜交（multiplexed error-robust FⅠSH，MERFⅠSH） 的 方法。該方法利用二進(jìn)制條形碼，在檢測時會將單個檢測錯誤進(jìn)行自動校正，只有當(dāng)檢測錯誤為多個時，才會識別為另一個轉(zhuǎn)錄本。除此以外，該方法還結(jié)合了組合標(biāo)記、順序雜交和成像等方法，可檢測單個細(xì)胞中數(shù)千種RNA 的拷貝數(shù)和空間定位。Moffitt 等［17］通過對MERFⅠSH 進(jìn)行一系列改進(jìn)，包括使用化學(xué)裂解代替光漂白來去除連續(xù)兩輪smFⅠSH 成像之間的熒光信號，增加成像視野并使用多色成像。通過這些改進(jìn)，在一次18 h的測量中就檢測了多達(dá)40 000個細(xì)胞［18］。除此以外，Wang等［19］開發(fā)了一種結(jié)合MERFⅠSH 和擴(kuò)展顯微鏡（expansion microscopy）的方法，擴(kuò)展顯微鏡可以有效擴(kuò)大相鄰分子之間的距離，顯著增加了可測量的RNA 的總密度，使得檢測效率提高近1 倍，單日可測量數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞，可測到的轉(zhuǎn)錄本密度是以前的10倍以上，并且可與免疫熒光技術(shù)相結(jié)合。這些改進(jìn)大大擴(kuò)展了MERFⅠSH可解決的生物學(xué)問題的范疇。

Fig.1 The principle of spatial transcriptome technologies based on in situ hybridization圖1 基于原位雜交的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)原理

總而言之，smFⅠSH 及其衍生方法可應(yīng)用于組織切片和體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因表達(dá)測量。該類技術(shù)已成功應(yīng)用于細(xì)胞間異質(zhì)性的研究［20］和瘧原蟲感染的紅細(xì)胞基因表達(dá)的研究［21］，還應(yīng)用于一些模式動物如果蠅、秀麗隱桿線蟲和斑馬魚等的相關(guān)研究中［22］。但是該方法在組織中的應(yīng)用效果不如在培養(yǎng)細(xì)胞中的應(yīng)用效果好，這是由于組織中的應(yīng)用受到組織自發(fā)熒光的影響。而且隨著復(fù)用探針次數(shù)的增加，組織背景的強(qiáng)度也增加，同時背景強(qiáng)度也隨著組織復(fù)雜程度的增加而增加。Moffitt等［23］開發(fā)了一種降低組織背景的smFⅠSH 方法，smFⅠSH實(shí)驗(yàn)操作過程中背景的主要來源是探針與非RNA的細(xì)胞成分（例如蛋白質(zhì)）非特異性結(jié)合。該方法的關(guān)鍵在于通過將RNA 分子錨定在不可膨脹的聚丙烯酰胺基質(zhì)上，再去除不需要的非RNA 成分（蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等）。研究人員在成年小鼠下丘腦的冰凍切片上使用MERFⅠSH方法對130種RNA進(jìn)行檢測，所得到的成像結(jié)果證明，該方法大大降低了成像時的組織背景干擾信號，能夠清晰地觀察到代表單個RNA分子的熒光點(diǎn)。

1.2 基于高通量測序 （high-throughput sequencing）的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

1.2.1 LCM-RNA-seq技術(shù)

1996 年，Emmert 等［24］開發(fā)了激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection，LCM）。該技術(shù)可以在保留空間位置信息的前提下，可視化地從切片中快速且準(zhǔn)確地捕獲目標(biāo)細(xì)胞［25］，現(xiàn)已被廣泛用于生物學(xué)研究中。該技術(shù)原理是將組織切片貼在特殊薄膜覆蓋的玻璃載玻片上，組織切片經(jīng)過染色后，在顯微鏡下可視化地進(jìn)行特定細(xì)胞的選擇、激光切割和分選，收集組織中特定的細(xì)胞樣品。分選獲得的細(xì)胞可以進(jìn)行特定基因表達(dá)的分析，結(jié)合基因芯片或測序技術(shù)（圖2a），對分選細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行解析［26］。該技術(shù)分選的細(xì)胞可來源于活細(xì)胞培養(yǎng)物、新鮮冷凍組織和福爾馬林固定的石蠟包埋組織等。

目前基于激光顯微切割的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，已應(yīng)用于非常少量的細(xì)胞，甚至單細(xì)胞的分選。2016年，Peng 等［27］通過整合與優(yōu)化LCM 和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single cell RNA-seq）技術(shù)，構(gòu)建了一種能解析少量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息，同時保留細(xì)胞原有位置信息的方法。通過LCM 分區(qū)捕獲，可以得到小鼠胚胎E7.0 時期的轉(zhuǎn)錄組信息，以及各個區(qū)域的標(biāo)志基因，將這些標(biāo)志基因作為“郵政編碼（zipcode）”，用于推斷空間坐標(biāo)，從而將未知來源的胚胎細(xì)胞“映射”到體內(nèi)胚胎的特定位置。

最近，Moor等［28］利用基于激光顯微切割的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)獲得組織空間區(qū)域特異性的標(biāo)志基因，通過標(biāo)志基因的表達(dá)將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)定位到組織空間，獲得單細(xì)胞分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組信息。他們使用激光顯微切割技術(shù)將小鼠小腸絨毛底部到頂部之間5個等間隔的區(qū)域進(jìn)行切割，分別捕獲各個區(qū)域的上皮細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。他們通過差異表達(dá)分析獲得每個區(qū)域的腸上皮細(xì)胞標(biāo)志性基因，建立不同空間的基因坐標(biāo)，并利用這些坐標(biāo)將單細(xì)胞“映射”到小腸絨毛的對應(yīng)區(qū)域。該方法也在其他器官的空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究中得到成功應(yīng)用，如肝小葉組織［29］。

目前基于激光顯微切割的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已在腫瘤生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及各類疾病生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮積極的作用。通過激光顯微切割獲得細(xì)胞的具體空間位置，根據(jù)研究目的將分選的細(xì)胞構(gòu)建不同的測序文庫，通過一次高通量轉(zhuǎn)錄組測序，就能獲得大量已知和未知基因的表達(dá)信息，甚至可以得到可變剪切的基因信息。隨著測序成本的不斷降低，該方法用于研究空間轉(zhuǎn)錄組具有很高的性價比。

1.2.2 HDST和Slide-Seq

2019 年Vickovic 等［30］提出了高分辨空間轉(zhuǎn)錄組（high-definition spatial transcriptomics，HDST）測序方法，通過在載玻片表面雕刻2.05 μm的大量小孔，將直徑為2 μm的硅膠磁珠分配到這些孔里，通過在磁珠表面連接帶有特定barcode 序列以及多種唯一分子標(biāo)識符（unique molecular identifiers，UMⅠs）和poly-dT的寡核苷酸鏈，來捕獲對應(yīng)位置細(xì)胞的mRNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序。同一時期，Rodriques等［31］發(fā)明了類似的Slide-Seq 方法，該方法用帶已知barcode 修飾的直徑為10 μm磁珠覆蓋的玻片（磁珠同時連有不同的UMⅠs 以 及poly-dT），捕 獲 帶poly（A）尾 的mRNA，進(jìn)行cDNA 合成后建庫測序（圖2b）。這兩種方法通過結(jié)合測序數(shù)據(jù)和圖像處理，都可以將基因表達(dá)情況可視化地比對到原始的組織切片中，得到非常直觀的結(jié)果，通量大且分辨率高。但其存在一定比例的磁珠會同時比對到兩種細(xì)胞類型的情況，且磁珠的捕獲效率仍然有待提高。

Fig.2 The principles of space transcriptome technologies based on high-throughput sequencing圖2 基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)原理

1.2.3 10×Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

2019 年，10× Genomics 公司推出了Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，結(jié)合顯微成像技術(shù)和RNA 測序技術(shù)，將染色后的組織切片與不同空間位置細(xì)胞的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)相結(jié)合。利用Visium 技術(shù)，可以從整個組織切片獲得高通量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員可以通過此技術(shù)研究正常和疾病組織的細(xì)胞組成及其與基因表達(dá)的關(guān)系，可用于發(fā)現(xiàn)新的組織生物標(biāo)志物。基于此技術(shù)，研究人員還開發(fā)了整合可視化基因表達(dá)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的軟件，可以在一個工作日之內(nèi)完成從對樣品切片到建好測序文庫。

Visium技術(shù)的原理是利用載有poly（A）和空間barcode 標(biāo)記的載玻片，原位捕獲對應(yīng)細(xì)胞的mRNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過高通量測序結(jié)合原位的barcode 信息，繪制復(fù)雜組織樣品的空間基因表達(dá)圖譜。該技術(shù)所使用的一張玻片可容納4片組織切片，將組織切片貼在具有5 000個空間捕獲區(qū)域的載玻片上，每個空間捕獲區(qū)域中包含數(shù)百萬個含有poly-dT 的寡核苷酸鏈，這些寡核苷酸鏈可以捕獲mRNA，寡核苷酸鏈連接有唯一的分子標(biāo)識符UMⅠ（計(jì)數(shù)mRNA 分子）和barcode（每個barcode對應(yīng)特定的捕獲區(qū)域）。每個空間區(qū)域的直徑為55 μm，可以檢測到1～10個細(xì)胞［32-33］。Visium技術(shù)的操作流程是首先將樣品進(jìn)行冰凍切片，貼在載玻片上的捕獲區(qū)域。利用標(biāo)準(zhǔn)的固定和染色技術(shù)對切片進(jìn)行染色，然后對切片進(jìn)行透化，釋放mRNA，讓其與空間區(qū)域中帶有poly-dT 序列的引物進(jìn)行結(jié)合，然后合成cDNA。之后，將每個空間區(qū)域反轉(zhuǎn)形成的cDNA合并回收，進(jìn)行最終文庫的構(gòu)建以及測序，通過數(shù)據(jù)分析軟件即可獲得細(xì)胞在組織原始的空間位置所發(fā)生的基因轉(zhuǎn)錄情況［34］。

2019 年，Maniatis 等［35］使 用10× Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，研究肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）模型小鼠以及ALS 患者死后脊髓組織的基因表達(dá)。ALS 導(dǎo)致的癱瘓是由于運(yùn)動神經(jīng)元退化造成骨骼肌神經(jīng)支配失調(diào)，但是對完整的脊髓組織中分子發(fā)生過程的時空順序仍然知之甚少。該團(tuán)隊(duì)通過10× Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)表征了鞘脂信號在多種細(xì)胞類型、脊髓區(qū)域和疾病階段的動力學(xué)，為之后藥物的設(shè)計(jì)及治療策略提供了方向。

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)此前已成功應(yīng)用于小鼠大腦復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究。大腦的空間結(jié)構(gòu)與其功能是緊密相關(guān)的，研究大腦的空間結(jié)構(gòu)有助于更好地理解神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)精神病學(xué)和神經(jīng)退行性疾病。 2020 年， Maynard 等［36］首 次 使 用10×Genomics Visium 技術(shù)獲得了人類背外側(cè)前額葉皮層（dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC）的空間基因表達(dá)圖譜。根據(jù)組織學(xué)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，DLPFC可以分為6層（L1～L6），Maynard等通過Visium技術(shù)構(gòu)建了DLPFC 空間基因表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)了很多以前未得到充分認(rèn)識的、但可能具有更高保真度的空間分層特有標(biāo)記基因，包括HPCAL1（L2）、KRT17（L6）和TRABD2A（L5），這些基因可用于人類大腦單細(xì)胞RNA測序的分層注釋。

10× Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組測序可以對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，與組織切片形貌進(jìn)行結(jié)合，深入探究細(xì)胞在特定空間位置上的生物學(xué)功能。下一步如果將免疫熒光標(biāo)記和10× Genomics Visium 技術(shù)結(jié)合起來，可以把蛋白質(zhì)檢測和整個轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合，在空間范圍下探索轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)的關(guān)系。

1.3 基于原位測序的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

1.3.1 原位測序（ⅠSS）

2013 年，Ke 等［37］開發(fā)了原位測序（in situsequencing，ⅠSS）方法，該方法在固定的組織或細(xì)胞中先將mRNA 在原位逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用RNA 酶H 使cDNA 上的RNA 鏈降解，再通過鎖式探針（padlock probe）與cDNA 雜交。由于探針末端之間有缺口，可以通過DNA聚合和DNA連接使鎖式探針形成一個完整的環(huán)，稱為“DNA球”，通過滾環(huán)擴(kuò)增（rolling-circle amplification，RCA）形成滾環(huán)產(chǎn)物（rolling-circle product，RCP）（圖3a）。之后，在顯微鏡下觀察熒光團(tuán)偶聯(lián)的寡核苷酸雜交，這是一個循環(huán)。在進(jìn)行下一個循環(huán)之前，要將之前的探針沖洗干凈，再重復(fù)連接、成像、沖洗的步驟來進(jìn)行下一個寡核苷酸的測序，直至幾個循環(huán)完成（圖3b）。通過圖像分析獲得的堿基順序來實(shí)現(xiàn)原位測序（圖3c）。組織中可分辨的基因數(shù)量與熒光團(tuán)的數(shù)量以及測序周期數(shù)有關(guān)，F(xiàn)個熒光團(tuán)和n個測序周期可解碼Fn個不同的序列條碼，如4 個熒光團(tuán)和4個測序周期（得到4個核苷酸長度的序列），則可以解碼44=256 個不同的序列條碼。除此以外，ⅠSS首次實(shí)現(xiàn)了對小RNA片段的組織原位測序。

利用該技術(shù)，Ke等［37］對人類乳腺癌組織切片中的突變位點(diǎn)進(jìn)行了原位測序，并揭示了其基因表達(dá)特征。2014 年，Pacureanu 等［38］開發(fā)了一種基于圖像的方法，每個文庫都用熒光染料標(biāo)記，該染料為每個RCP 生成特定的顏色（對應(yīng)于匹配的堿基），并使用染料專用濾光片通過熒光顯微鏡獲取不同焦平面的圖像，可對細(xì)胞和組織中的大量RNA片段進(jìn)行測序。他們對3個HER2陽性新鮮冷凍乳腺癌組織切片進(jìn)行了原位RNA 表達(dá)和定位分析，通過成像區(qū)分腫瘤與非腫瘤之間的界限。

ⅠSS適用于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組織或細(xì)胞，它可以對單個RNA 分子進(jìn)行測序，分辨率高，為研究復(fù)雜的生物學(xué)事件提供了新的途徑，例如原位異質(zhì)細(xì)胞群體中的細(xì)胞分化［37］。然而，ⅠSS的主要缺點(diǎn)在于一次實(shí)驗(yàn)所能識別到的RNA 數(shù)量較少，且使用的鎖式探針可能會產(chǎn)生大量的探針特定偏差，即使結(jié)合了圖像的方法，增加了識別到的RNA 數(shù)量，但還需要處理大量圖像數(shù)據(jù)，且需要高分辨率的顯微成像才能夠準(zhǔn)確獲得堿基對信息，掃描出來的圖像數(shù)據(jù)通常非常大，這對圖像分析有不小的挑戰(zhàn)。

Fig.3 The principle of in situ sequencing圖3 靶向原位測序原理

1.3.2 熒光原位測序（FⅠSSEQ）

ⅠSS 技術(shù)中，鎖式探針可能會產(chǎn)生大量的探針特定偏差，而且ⅠSS技術(shù)通常僅限于有明確注釋基因的檢測。針對這些問題，2015 年，Lee 等［39］開發(fā)了熒光原位測序（fluorescencein situsequencing，F(xiàn)ⅠSSEQ）技術(shù)，利用隨機(jī)六聚體引物在固定細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄RNA，然后通過cDNA 的環(huán)化以非靶向方式生成測序文庫。該方法進(jìn)一步提高了原位測序技術(shù)的檢測通量，能獲得全基因組范圍的基因表達(dá)圖譜，包括基因表達(dá)，RNA剪接和轉(zhuǎn)錄后修飾等，同時保留了它們的空間位置信息。

FⅠSSEQ 技術(shù)首先將細(xì)胞固定在載玻片上，然后原位進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后，將殘留的RNA 降解以防止其競爭性抑制雙鏈DNA 環(huán)化連接酶（CircLigase）。cDNA片段在60°C環(huán)化，CircLigase將環(huán)化后的cDNA 連接起來，之后進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（rolling-circle amplification，RCA），將每個cDNA環(huán)形擴(kuò)增為包含多個原始cDNA 序列的滾環(huán)產(chǎn)物（RCP）（圖4）。該過程中，在第k個循環(huán)引入熒光標(biāo)簽，對應(yīng)于該cDNA 鏈的第k個堿基，然后再進(jìn)行成像。之后沖洗掉熒光標(biāo)簽，再進(jìn)行下一個循環(huán)。FⅠSSEQ 技術(shù)適合有細(xì)胞顯微操作經(jīng)驗(yàn)的研究人員，文庫構(gòu)建和測序可以在14 d內(nèi)完成，該技術(shù)對計(jì)算處理能力的要求較低，圖像分析大約只需2 d［39］。

Fig.4 The principle of rolling-circle amplification in FISSEQ圖4 熒光原位測序的滾環(huán)擴(kuò)增原理

FⅠSSEQ 技術(shù)的優(yōu)勢在于，對于功能重要的轉(zhuǎn)錄本，其富集程度是單細(xì)胞RNA-seq的10倍以上。FⅠSSEQ 方法的局限性在于獲得的基因數(shù)遠(yuǎn)少于RNA-seq，每個細(xì)胞僅獲得約200 個mRNA 片段，而單細(xì)胞RNA-seq 則約為40 000 個mRNA 片段。該方法測序深度低，即使最初去除了rRNA，但rRNA 讀數(shù)仍占總讀數(shù)的40%～80%。除此以外，RCP 的大小又會限制每個細(xì)胞所能得到的讀數(shù)，從而限制了該方法的靈敏度［34］。FⅠSSEQ無法提供單個細(xì)胞內(nèi)RNA 的完整信息，會丟失低豐度的轉(zhuǎn)錄本［40］。

FⅠSSEQ 技術(shù)適用于大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞和組織切片的樣品（包括石蠟切片和冰凍切片），也適用于果蠅胚胎、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞及類器官等組織。FⅠSSEQ 測序得到的每個read 均有空間坐標(biāo)，可以用于分析轉(zhuǎn)錄本在原位的分布情況。FⅠSSEQ 技術(shù)還可以與鎖式探針技術(shù)結(jié)合，來檢測癌組織中特異的RNA標(biāo)志物。除此以外，F(xiàn)ⅠSSEQ還可以對單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序［34］。

1.3.3 STARmap技術(shù)

2018 年， Wang 等［41］開 發(fā) 了STARmap（spatially-resolved transcript amplicon readout mapping）方法，將水凝膠的組織化學(xué)方法和原位測序相結(jié)合，可應(yīng)用于完整的組織。STARmap 技術(shù)首先去除組織中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，將組織轉(zhuǎn)化為3D 水凝膠，降低成像背景，再用鎖式探針與cDNA 結(jié)合，進(jìn)行酶促擴(kuò)增，形成“DNA 球”，這一過程相當(dāng)于原位測序的滾環(huán)擴(kuò)增。接著進(jìn)行成像，成像一輪后使用60%甲酰胺將探針從組織水凝膠中洗脫下來，再開始下一個循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)對完整組織的3D原位測序。

1.4 基于活細(xì)胞標(biāo)記的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

1.4.1 TⅠVA

上述幾類空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，需要對組織進(jìn)行切片，而組織一旦切片，就無法獲得完整單細(xì)胞的基因表達(dá)信息，當(dāng)前的捕獲方法難以從單個細(xì)胞中分離出mRNA 而不損害相鄰組織。2014 年，Lovatt等［42］開發(fā)了一種新的空間轉(zhuǎn)錄組方法——TⅠVA（transcriptomein vivoanalysis），第一次非破壞性地從活細(xì)胞中捕獲mRNA。該方法設(shè)計(jì)了一種光激活的標(biāo)簽（TⅠVA-tag），TⅠVA-tag包括一段poly（U）序列和兩個poly（A）片段，該標(biāo)簽通過二硫鍵連接的細(xì)胞穿透肽穿透細(xì)胞膜，以使TⅠVA-tag 進(jìn)入細(xì)胞，之后在細(xì)胞中進(jìn)行光裂解，使得poly（U）序列暴露出來，并與細(xì)胞中mRNA的poly（A）尾退火連接。組織裂解后，用鏈霉親和素和磁珠純化得到TⅠVA-tag-mRNA 結(jié)合產(chǎn)物。之后，將mRNA 洗脫下來，進(jìn)一步用于轉(zhuǎn)錄組分析（圖5）。

TⅠVA適用于活細(xì)胞或活組織，Lovatt等［42］對比了TⅠVA-tag 方法和移液管吸取方法捕獲的單個神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性，結(jié)果顯示無顯著差異（P= 0.2396，t檢驗(yàn)）。除此以外，Lovatt 等［42］還在小鼠大腦的海馬體活組織切片中使用了TⅠVA-tag方法，證明了光活化的TⅠVA-tag 可以保留在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，不會遷移到鄰近細(xì)胞。TⅠVA-tag可從活組織切片中的單個細(xì)胞中捕獲大小和豐度不同的mRNA，而不會造成明顯的細(xì)胞損傷。利用TⅠVAtag 方法，他們還鑒定了人腦組織切片中單個細(xì)胞的基因表達(dá)，證明TⅠVA 可用于表征人類細(xì)胞在原位組織環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄組。2017年，Yeldell等［43］對原始TⅠVA 探針進(jìn)行改進(jìn)，增強(qiáng)了光解前的熱穩(wěn)定性，提高了光解后對mRNA的捕獲親和力。

TⅠVA 方法與RNA-seq 的結(jié)合能獲得具有空間信息的完整單細(xì)胞基因表達(dá)信息，而不是某個切片或者部分單細(xì)胞的基因表達(dá)信息，從而為研究復(fù)雜的組織微環(huán)境對完整單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響提供了一種可靠途徑。但是該方法目前不適用于大量細(xì)胞的分析，且因其只能穿透活細(xì)胞，對已處理過的組織樣品（例如固定后或冰凍后的組織樣品）不適用。

1.4.2 ZipSeq

2020 年，Hu 等［44］發(fā)明了ZipSeq 方法，用于活細(xì)胞和活組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組研究。該方法利用光控空間編碼進(jìn)行實(shí)時的活組織單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組研究。該技術(shù)將連有雙鏈DNA 片段的高親和力抗體或者脂質(zhì)修飾過的寡核苷酸（lipid-modified oligonucleotide，LMO）錨定到細(xì)胞膜表面，用特定模式照明，釋放特定組織區(qū)域細(xì)胞上錨定的雙鏈DNA 片段上所連接的籠鎖序列。再利用與該籠鎖序列相匹配的，且?guī)в胁煌瑉ipcode，以poly（A）序列以及Ⅰllumina 讀取序列結(jié)尾的單鏈雜交。該zipcode 作為組織細(xì)胞空間位置的識別序列，poly（A）序列作為反轉(zhuǎn)錄時poly-dT 引物的捕獲對象，對其進(jìn)行放大作為細(xì)胞空間位置鑒定的依據(jù)。該方法對活組織切片進(jìn)行位置標(biāo)記后，將細(xì)胞解離成單個細(xì)胞，再結(jié)合10×Genomics單細(xì)胞測序的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

Fig.5 The principle of TIVA圖5 TIVA原理

利用ZipSeq 技術(shù)，他們檢測了體外傷口愈合過程中細(xì)胞基因表達(dá)的變化情況、淋巴結(jié)活組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組情況以及腫瘤活組織內(nèi)空間轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況。每種模型中都發(fā)現(xiàn)了一些與組織結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)的新的基因表達(dá)模式。在腫瘤微環(huán)境中，基因表達(dá)模式表明了骨髓和T細(xì)胞由外圍向內(nèi)的分化軌跡。該方法還提供了兩種ZipSeq 的組合變體，可以有效縮放所定義區(qū)域的數(shù)量，從而為實(shí)時的或干擾之后的活組織基因表達(dá)模式的完整繪制提供了有效的途徑，但該方法在空間分辨率上仍然有待進(jìn)一步提高。

2 展 望

目前發(fā)展的各類空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)（表1）。總的來說，基于原位雜交技術(shù)的smFⅠSH 及其衍生的空間轉(zhuǎn)錄組方法在不斷地提高檢測的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目。但是檢測的通量和靈敏度還受到組織空間的限制，所獲得的基因表達(dá)信息只在一個組織層面上，還無法反映組織內(nèi)完整單細(xì)胞的基因表達(dá)情況，價格也相對昂貴?；诩す怙@微切割的空間轉(zhuǎn)錄組方法，可以直觀地分選出任何形態(tài)的細(xì)胞或細(xì)胞群，通過高通量測序獲得已知和未知的基因表達(dá)信息，具有較好的性價比。但是由于組織需要切片，同樣無法獲得組織內(nèi)完整單細(xì)胞的基因表達(dá)信息?；诮M織原位測序的空間轉(zhuǎn)錄組方法，空間分辨率較高，可以直觀地在較大組織切片尺度觀察基因表達(dá)的豐度情況，但是獲得的也是某個組織層面的細(xì)胞基因表達(dá)信息，檢測通量不高，且捕獲效率目前仍然非常有限。最近發(fā)展的活細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組方法，可以獲得具有空間信息的完整單細(xì)胞的基因表達(dá)情況，但對于細(xì)胞的精準(zhǔn)定位以及細(xì)胞通量還需要進(jìn)一步提高。

可以預(yù)見，這些空間轉(zhuǎn)錄組的方法將不斷克服各自的不足，包括防止RNA 的降解、提高檢測的通量和效率、降低成本和獲取完整空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組等。同時，在獲得細(xì)胞空間信息的基礎(chǔ)上，未來空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)將加入時間的維度，從時空轉(zhuǎn)錄組的角度進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)錄組的研究層次，不斷加深對組織細(xì)胞真實(shí)特性的理解，從而推進(jìn)對發(fā)育過程和癌癥等惡性疾病發(fā)生機(jī)制的理解和新治療方案的研究。

Table 1 Comparison of spatial transcriptome technologies表1 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)比較