張懷忠, 吳旭輝, 吳功志, 朱雙媚

麗水市人民醫(yī)院 1胸心外科， 2腫瘤放療科(浙江麗水 323000)

食管癌是世界上第八大癌癥，其病死率位于世界惡性腫瘤的第6位，是消化道系統(tǒng)及胃腸道最常見、最具侵襲性的腫瘤之一[1-2]。食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，Escc)是我國(guó)食管癌的主要病理類型，患者發(fā)病率及病死率較高[3-4]。隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)及放療等多學(xué)科治療雖能在一定程度上改善患者生存，但患者預(yù)后及5年生存率仍不理想[5]。故尋找有效的分子標(biāo)志物及探究Escc高侵襲遷移的分子機(jī)制，對(duì)改善Escc患者預(yù)后有潛在的臨床意義。研究證實(shí)微小RNA(MicroRNA，miRNA)與腫瘤遷移、侵襲關(guān)系密切[6]，miRNA家族的miR-205已被證實(shí)可增強(qiáng)DNA修復(fù)，抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)Escc細(xì)胞集落存活[7-8]。miR-205的亞型miR-205-5p也被發(fā)現(xiàn)參與皮膚鱗癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤的侵襲、遷移生物學(xué)過程[9-10]。但miR-205-5p在Escc侵襲、遷移過程中的調(diào)控機(jī)制研究較少。另外，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白47(RBM47)丟失是導(dǎo)致結(jié)直腸癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的重要因子之一[11-12]。但RBM47是否也參與Escc侵襲、遷移過程還未見報(bào)道。本研究2019年3月至2021年1月用基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-205-5p與RBM47之間存在靶向關(guān)系，并通過培養(yǎng)Escc細(xì)胞，探究miR-205-5p與RBM47在腫瘤侵襲遷移過程的調(diào)控機(jī)制，以期為Escc的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管上皮細(xì)胞(HET-1A)及人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(TE14和KYSE70)(上海細(xì)胞研究所，MZ0641、MZ-2281、MZ1694)；RPMI-1640培養(yǎng)基(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，GNM-31800)；10%胎牛血清(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，A3160801)；鏈霉素-青霉素混合液(北京百奧萊博科技有限公司，SJ0704)；CCK-8試劑盒(上海吉至生化科技有限公司，CA1210-5000T)；RNA提取試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司，TR205-50)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海科敏生物科技有限公司，205111)；Matrigel基質(zhì)膠(上海鈺博生物科技有限公司，YB356234)；RBM47、侵襲遷移相關(guān)蛋白E-鈣粘蛋白(E-cadherin)及鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒1(ZEB1)等抗體(美國(guó)abcam公司，ab154176、ab40772、ab203829)；ECL顯色試劑盒(上海古朵生物科技有限公司，GD-Y2042)；BCA蛋白定量試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，AR0146)；qRT-PCR儀(上海力康科技有限公司，T960)；酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司，Tecan Infinite F50)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取HET-1A及Escc細(xì)胞系(TE14和KYSE70)常規(guī)復(fù)蘇后，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素)，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞系中miR-205-5p、RBM47 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 用RNA提取試劑盒分別提取Escc細(xì)胞系(TE14和KYSE70)和HET-1A細(xì)胞系中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL，2×SYBR mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性20 s、60℃退火55 s、50個(gè)循環(huán)、72℃延伸15 min)。miR-205-5p以U6為內(nèi)參，RBM47以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt算法，計(jì)算miR-205-5p、RBM47 mRNA表達(dá)水平。各引物序列由大連寶生物公司合成，見表1。

表1 引物序列表

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組處理 取KYSE70細(xì)胞系，用胰蛋白酶消化后，按照5×104個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，并設(shè)置為空白對(duì)照組、miR-205-5p抑制劑(miR-205-5p-inhibitor)組、miR-205-5p抑制劑陰性對(duì)照(miR-205-5p-NC)組、RBM47過表達(dá)腺病毒(Ad-RBM47)組、Ad-RBM47陰性對(duì)照(Ad-eGFP)組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組不作任何處理正常培養(yǎng)，其余各組待細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑盒向KYSE70細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-205-5p-inhibitor及miR-205-5p-NC試劑，得到miR-205-5p-inhibitor組及miR-205-5p-NC組；采用腺病毒向KYSE70細(xì)胞轉(zhuǎn)染RBM47過表達(dá)序列及空載體，得到Ad-RBM47組及Ad-eGFP組。各轉(zhuǎn)染組于轉(zhuǎn)染后24 h，取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-205-5p、RBM47 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，按1.2.2項(xiàng)下的檢測(cè)方法，檢測(cè)各組細(xì)胞miR-205-5p、RBM47 mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞，加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀上于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值，以空白對(duì)照組為對(duì)照，根據(jù)公式細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組OD值/空白組OD值)×100%計(jì)算細(xì)胞存活率，以存活率代表細(xì)胞增殖活性。

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力 將轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞，重懸為濃度為1×108個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取Transwell小室，向小室上室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液100 μL，于小室下室加入含10 %胎牛血清的培養(yǎng)液室溫孵育24 h后，取出小室，用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色后，于光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)目多少代表細(xì)胞遷移能力。在Transwell小室上室鋪比例為(Matrigel膠∶培養(yǎng)基=1∶8)的普通Matrigel膠工作液50 μL，室溫孵育過夜過夜并待Matrigel膠凝固后，其余步驟同遷移試驗(yàn)，作為細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞RBM47、E-cadherin、ZEB1蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒及BCA定量試劑盒提取并測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度后，取50 μg蛋白樣品行電泳及半干法轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗(RBM47、E-cadherin、ZEB1抗體，稀釋倍數(shù)均為1∶1 500，內(nèi)參抗體GAPDH稀釋倍數(shù)為1∶2 000)，于4℃孵育過夜后，加入辣根過氧化物酶二抗(稀釋倍數(shù)1∶5 000)于室溫下孵育3 h。顯影曝光后，用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 雙熒光素酶驗(yàn)證miR-205-5p與RBM47的靶向關(guān)系 合成RBM47的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的miR-205-5p識(shí)別序列，克隆至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-RBM47-3′UTR-WT。另外對(duì)miR-205-5p識(shí)別區(qū)RBM47堿基進(jìn)行突變連接至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-RBM47-3′UTR-MUT，分別將pmiRGlo-RBM47-3′UTR-WT、pmiRGlo-RBM47-3′UTR-MUT質(zhì)粒與miR-205-5p NC、miR-205-5p mimics共轉(zhuǎn)染，得到miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-MUT組、miR-205-5p NC+RBM47-3′UTR-MUT組、miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-WT組、miR-205-5p NC+RBM47-3′UTR-WT組，各組均于24 h后添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑(按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書)上機(jī)檢測(cè)。每孔的數(shù)值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 miR-205-5p-inhibitor與si-RBM47共轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 取KYSE70細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于96 孔板內(nèi)，并設(shè)置為：miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47組、miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC組、miR-205-5p-NC+si-RBM47組、miR-205-5p-NC+si-RNA-NC組、未轉(zhuǎn)染組(空白對(duì)照組)，miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47組轉(zhuǎn)染miR-205-5p抑制劑及RBM47干擾載體(si-RBM47)；miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC組轉(zhuǎn)染miR-205-5p-inhibitor及RBM47空載體(si-RNA-NC)，miR-205-5p-NC+si-RBM47組轉(zhuǎn)染miR-205-5p-NC及si-RBM47；miR-205-5p-NC+si-RNA-NC組轉(zhuǎn)染miR-205-5p-NC及si-RNA-NC，空白對(duì)照組不作任何處理，各組均于轉(zhuǎn)染后24 h，取細(xì)胞按1.2.6方法檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系中miR-205-5p、RBM47 mRNA表達(dá)的影響 與正常食管上皮細(xì)胞(HET-1A)相比，ESCC細(xì)胞系(TE14和KYSE70)中miR-205-5p表達(dá)升高(P<0.05)，RBM47 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，其中在KYSE70細(xì)胞系中，miR-205-5p表達(dá)最高，RBM47 mRNA表達(dá)最低。見表2。

表2 不同細(xì)胞系中miR-205-5p、RBM47 mRNA表達(dá)比較

2.2 抑制miR-205-5p或激活RBM47表達(dá)對(duì)細(xì)胞miR-205-5p及RBM47 mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，miR-205-5p-inhibitor組細(xì)胞miR-205-5p表達(dá)降低(P<0.05)，RBM47表達(dá)升高(P<0.05)；Ad-RBM47組細(xì)胞RBM47 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，miR-205-5p表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-205-5p-NC組及Ad-eGFP組上述指標(biāo)與空白組對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞miR-205-5p及RBM47 mRNA表達(dá)比較

2.3 抑制miR-205-5p或激活RBM47表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 與空白對(duì)照組比較，miR-205-5p-inhibitor組及Ad-RBM47組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)。miR-205-5p-NC組及Ad-eGFP組上述指標(biāo)與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 抑制miR-205-5p或激活RBM47表達(dá)后各組細(xì)胞增殖活性比較

2.4 抑制miR-205-5p或激活RBM47表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 與空白對(duì)照組比較，miR-205-5p-inhibitor組及Ad-RBM47組細(xì)胞侵襲遷移能力降低(P<0.05)。miR-205-5p-NC組及Ad-eGFP組上述指標(biāo)與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表5。

圖1 各組細(xì)胞侵襲遷移Transwell圖(×200)

表5 各組細(xì)胞侵襲遷移能力比較 個(gè)

2.5 抑制miR-205-5p或激活RBM47表達(dá)對(duì)細(xì)胞RBM47、E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，miR-205-5p-inhibitor組及Ad-RBM47組細(xì)胞ZEB1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，E-cadherin、RBM47表達(dá)升高(P<0.05)。miR-205-5p-NC組及Ad-eGFP組上述指標(biāo)與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表6。

注：A：空白對(duì)照組；B：miR-205-5p-NC組；C：Ad-eGFP組；D：miR-205-5p-inhibitor組；E：Ad-RBM47組

表6 各組細(xì)胞中RBM47、E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)水平比較

2.6 雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證miR-205-5p與RBM47靶向關(guān)系 miRtarbase預(yù)測(cè)顯示，miR-205-5p與RBM47有結(jié)合位點(diǎn)。與miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT組比較，miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-WT組熒光素酶活性降低(P<0.05)，miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-MUT組、miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-MUT組熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3～4。

圖3miRtarbase預(yù)測(cè)miR-205-5p與RBM47靶向關(guān)系

注：A：miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT；B：miR-205-5p NC+RBM47-3′UTR-MUT組；C：miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-WT組；D：miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-MUT組；*與miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT比較P<0.05

2.7 miR-205-5p-inhibitor與si-RBM47共轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞侵襲遷移能力影響 與空白對(duì)照組比較miR-125b-NC+si-RBM47組細(xì)胞侵襲遷移能力升高(P<0.05)；miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC組細(xì)胞侵襲遷移能力降低(P<0.05)。與miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC組相比，miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47組細(xì)胞侵襲遷移能力升高(P<0.05)。miR-125b-NC+si-RNA-NC組與空白對(duì)照組相比，上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、表7。

圖5 各組細(xì)胞侵襲遷移Transwell圖(×200)

表7 各組細(xì)胞侵襲遷移能力比較 個(gè)

3 討論

據(jù)世界流行病學(xué)分析，預(yù)計(jì)到2040年世界食管癌患病率及病死率將是2018年患病人數(shù)的1.6倍左右[12]。食管癌中的亞型-Escc因其較高的發(fā)病率及轉(zhuǎn)移率，而受到臨床研究的重視[13]。MicroRNA(miR)與腫瘤增殖、凋亡及侵襲、遷移等生物學(xué)過程關(guān)系密切，且是最有前途的癌癥診斷生物標(biāo)志物之一[14]。余長(zhǎng)云等[15]及Liu等[16]發(fā)現(xiàn)沉默miR-205-5p可抑制頭頸鱗狀細(xì)胞癌及結(jié)直腸癌的增殖、侵襲、遷移過程，提示miR-205-5p可作為促癌基因發(fā)揮生物學(xué)過程。楊屹立等[17]及Yamada等[18]發(fā)現(xiàn)miR-205-5p過表達(dá)可抑制胃癌及前列腺癌的增長(zhǎng)及遷移過程，提示miR-205-5p可作為抑癌基因參與腫瘤生物學(xué)過程。而miR-205-5p在Escc發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控作用研究較少。Ibuki等[6]發(fā)現(xiàn)miR-205-5p在Escc患者血清中表達(dá)水平高于食管腺癌患者，提示miR-205-5p過表達(dá)可能是導(dǎo)致Escc侵襲與轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p在Escc細(xì)胞系(TE14和KYSE70)中表達(dá)均異常高于人正常食管上皮細(xì)胞系(HET-1A)，且抑制KYSE70細(xì)胞中miR-205-5p表達(dá)后，KYSE70細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力顯著低于空白對(duì)照組，提示miR-205-5p在Escc細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，沉默其表達(dá)可抑制Escc惡性生物學(xué)過程。研究證實(shí)E-cadherin為抑癌因子，ZEB1為致癌因子，且兩者與腫瘤侵襲遷移關(guān)系密切[19]。范曉娜等[20]發(fā)現(xiàn)雙皮質(zhì)素樣激酶1基因敲除可通過抑制ZEB1表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，影響Escc細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)抑制Escc細(xì)胞侵襲遷移進(jìn)程，提示E-cadherin、ZEB1與Escc侵襲遷移過程有關(guān)。本研究也在miR-205-5p抑制劑組檢測(cè)到miR-205-5p表達(dá)降低后，與Escc侵襲遷移相關(guān)蛋白E-cadherin上調(diào)，ZEB1蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步證實(shí)，抑制miR-205-5p表達(dá)，可抑制Escc侵襲遷移進(jìn)程。但miR-205-5p促進(jìn)Escc惡性生物學(xué)進(jìn)程的分子機(jī)制還需繼續(xù)探究。

RNA結(jié)合蛋白(RBP)在腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲遷移過程也發(fā)揮重要作用[21]。研究證實(shí)RNA結(jié)合蛋白R(shí)BM47可調(diào)控mRNA剪接、堿基編輯及多聚腺苷化過程，并在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮顯著作用[11]。Blanc等[22]發(fā)現(xiàn)RBM47基因敲除可抑制小鼠腸道RNA基因編輯，并推測(cè)RBM47降低可能是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因子。Vanharanta等[23]發(fā)現(xiàn)RBM47能改變靶mRNA子集的剪接和翻譯，可通過使其靶RNA失活抑制乳腺癌的重新啟動(dòng)和生長(zhǎng)，并推測(cè)RBM47的丟失是導(dǎo)致乳腺癌侵襲遷移的重要原因之一。本研究也發(fā)現(xiàn)，RBM47在Escc細(xì)胞系(TE14和KYSE70)中表達(dá)均異常低于人正常食管上皮細(xì)胞系(HET-1A)，且上調(diào)RBM47在KYSE70中表達(dá)后，隨著RBM47 mRNA及蛋白表達(dá)的升高，與Escc侵襲遷移相關(guān)蛋白E-cadherin上調(diào)，ZEB1蛋白表達(dá)降低，Escc細(xì)胞表現(xiàn)出較低的侵襲遷移能力，提示RBM47可抑制Escc細(xì)胞侵襲遷移進(jìn)程。本研究還發(fā)現(xiàn)，抑制miR-205-5p表達(dá)后，RBM47 mRNA及蛋白也呈升高趨勢(shì)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-205-5p與RBM47存在靶向負(fù)調(diào)控作用。為明確二者關(guān)系，本研究采用miR-205-5p-inhibitor與si-RBM47共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47組細(xì)胞侵襲遷移能力顯著高于miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC組，提示RBM47低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-205-5p-inhibitor對(duì)Escc侵襲遷移能力的抑制作用。

綜上所述，Escc細(xì)胞中miR-205-5p表達(dá)升高，RBM47表達(dá)降低，下調(diào)miR-205-5p表達(dá)可抑制Escc細(xì)胞侵襲遷移能力，其抑制作用可能與上調(diào)RBM47表達(dá)有關(guān)，這為闡明Escc發(fā)生發(fā)展的靶向調(diào)控機(jī)制提供一定理論依據(jù)，但本研究還存在一定的不足，miR-205-5p的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，miR-205-5p與Escc的其他靶向調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：張懷忠提出研究思路、設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過程、論文撰寫；吳旭輝、吳功志資料收集整理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，指導(dǎo)論文修改。