韓亞雯，賴貞霖，張夢(mèng)美，趙慧英，劉騰飛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.惠農(nóng)區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，石嘴山 753600)

奶山羊作為重要的奶畜之一，近幾年倍受重視，產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢(shì)良好，已成為地方畜牧經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。然而，由于良種繁育體系缺乏、選育工作滯后等因素，我國(guó)部分地區(qū)奶山羊個(gè)體小、產(chǎn)奶量低、泌乳期短，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。當(dāng)前，要充分發(fā)揮我國(guó)現(xiàn)有少數(shù)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶山羊品種在改造低產(chǎn)奶山羊中的作用，就必須借助人工授精的方法，而作為其核心環(huán)節(jié)的精液保存就成為加速我國(guó)奶山羊品種改良和培育的關(guān)鍵技術(shù)[2]。

精液保存分為冷凍保存和液態(tài)保存，冷凍保存能夠?qū)崿F(xiàn)精液的長(zhǎng)期保存，但凍融過程會(huì)引起精子生理生化指標(biāo)異常、受精能力和存活率下降，降低繁殖成功率[3]。液態(tài)保存是在非冷凍的液態(tài)條件下實(shí)現(xiàn)的，不僅工藝操作簡(jiǎn)便、利于運(yùn)輸，更重要的是能減少凍融過程對(duì)精子的損傷，是精液保存較為理想的方式[4]。但是，液態(tài)保存時(shí)間短，精子活力下降迅速，極大限制了該技術(shù)的發(fā)展和推廣，因此迫切需要探明影響液態(tài)保存效果的關(guān)鍵因素[5]。大量研究表明，精子結(jié)構(gòu)損傷是影響精子液態(tài)保存質(zhì)量的重要因素[6-7]。電子顯微鏡技術(shù)已被廣泛用于精子形態(tài)學(xué)研究，到目前為止，已報(bào)道人[8]、犬[9]和羊[10]等精子冷凍保存過程中的超微結(jié)構(gòu)損傷，但鮮有報(bào)道涉及液態(tài)保存中奶山羊精子超微結(jié)構(gòu)變化。

本研究采集關(guān)中奶山羊精液并進(jìn)行4 ℃液態(tài)保存，利用伊紅染色檢測(cè)精子活率變化，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察精子超微結(jié)構(gòu)改變，研究結(jié)果為闡明影響奶山羊精子液態(tài)保存質(zhì)量的相關(guān)機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器設(shè)備

1.1.1 主要試劑 Tris、果糖、檸檬酸、青霉素、鏈霉素購(gòu)自杭州弗德生物公司；常規(guī)生化試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器 自動(dòng)熒光顯微鏡(LECIA DM6B)、場(chǎng)發(fā)射SEM(Nano SEM-450)、臨界點(diǎn)干燥儀(EM CPD300)、TEM(TECNAI G2 SPIRIT BIO)、徠卡修塊機(jī)(EM TRIM2)、超薄切片機(jī)(EM UC7)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奶山羊精液采集 選取6只2～3歲、繁殖性能良好、健康的雄性關(guān)中奶山羊(陜西省千陽(yáng)縣種羊場(chǎng))，采用假陰道法收集新鮮精液，精子濃度大于3×109個(gè)·mL-1、精子活力在90%以上的精液用于試驗(yàn)。

1.2.2 精液稀釋與4 ℃液態(tài)保存 合格精液用37 ℃稀釋液(Tris：36.3 mg·mL-1；果糖：5.0 mg·mL-1；檸檬酸：19.9 mg·mL-1；蛋黃：100 mL·L-1；青霉素：50 IU·mL-1；鏈霉素：1 mg·mL-1)稀釋至3×108個(gè)·mL-1，緩慢降溫至4 ℃，并開始計(jì)算保存時(shí)間。每隔24 h收集精液樣品，以精子活率>50%計(jì)為有效液態(tài)保存期。

1.2.3 伊紅染色檢測(cè)精子活率 各組精液樣品稀釋至3×106個(gè)·mL-1，每組設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。精液樣品和伊紅染色液以1∶1比例混合均勻，LECIA DM6B顯微鏡觀察。

1.2.4 SEM和TEM觀察精子超微結(jié)構(gòu) 基于伊紅染色結(jié)果，選取0、48、96 h精液樣品在SEM和TEM下觀察超微結(jié)構(gòu)，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。精液樣品用PBS緩沖液洗滌3次，2.5%戊二醛4 ℃固定24 h。乙醇梯度脫水后臨界點(diǎn)干燥儀干燥3 h、粘臺(tái)、噴金和上樣，場(chǎng)發(fā)射SEM觀察。1%鋨酸固定1.5 h，精子經(jīng)乙醇梯度脫水并用白膠浸潤(rùn)，滲透包埋。采用超薄切片機(jī)切片，2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛避光處理10 min，TEM觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，通過單因素方差分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異性，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子活率變化

伊紅染色檢測(cè)4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子活率，結(jié)果顯示：隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，精子活率逐漸降低(圖1)。0 h精子活率為95.4%；與0 h相比，保存至24 h后，精子活率均顯著降低(P<0.05)，144 h的精子活率小于50%?；谝陨辖Y(jié)果，收集0、48、96 h精液樣品進(jìn)行后續(xù)超微結(jié)構(gòu)研究。

A～G.分別為0、24、48、72、96、120和144 h精子染色圖；H.精子活率，柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 SEM觀察4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子超微結(jié)構(gòu)變化

SEM觀察4 ℃液態(tài)保存至0、48、96 h奶山羊精子超微結(jié)構(gòu)(圖2)。0 h時(shí)，精子頭、頸、尾部形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，頭部為扁卵圓形，由細(xì)胞核和頂體組成，頂體完整，邊界清晰光滑，尾部(中段、主段、末端)結(jié)構(gòu)完好(圖2A)；保存至48 h，部分精子出現(xiàn)畸形，表現(xiàn)為精子窄頭(圖2B)，尾部斷裂卷曲(圖2C)，結(jié)構(gòu)損傷精子為34.7%(圖2G)；保存至96 h，精子頂體破損(圖2D)，尾部主段斷裂(圖2E)，尾部中段線粒體鞘腫脹(圖2F)，結(jié)構(gòu)損傷精子大于60%(圖2G)。

A.0 h，形態(tài)正常精子，比例尺=10 μm；B.48 h精子形態(tài)，箭頭指向窄頭，比例尺=10 μm；C.48 h精子形態(tài)，箭頭指向尾部斷裂卷曲，比例尺=5 μm；D.96 h精子形態(tài)，箭頭指向頂體破損，比例尺=5 μm；E.96 h精子形態(tài)，箭頭指向主段斷裂，比例尺=10 μm；F.96 h精子形態(tài)，箭頭指向線粒體鞘腫脹，比例尺=2 μm；G.結(jié)構(gòu)損傷精子所占比例，* P<0.05與0 h對(duì)比。N.核，Ac.頂體，St.精子尾部，Ms.線粒體鞘。下同

2.3 TEM觀察4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子超微結(jié)構(gòu)變化

TEM觀察4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子超微結(jié)構(gòu)變化(圖3～5)。0 h時(shí)奶山羊精子形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖3)，頭部質(zhì)膜完整光滑，頂體內(nèi)膜與核膜緊密結(jié)合，核染色質(zhì)電子密度均勻(圖3A、3B)。精子尾部結(jié)構(gòu)完好，中段線粒體鞘結(jié)構(gòu)完整，包裹的軸絲清晰可見，外包質(zhì)膜，線粒體排列規(guī)則、分布均勻、形態(tài)大小正常(圖3C)。保存至48 h，結(jié)構(gòu)損傷精子所占比例為41.3%(圖6)，部分精子核膜膨脹折疊呈花環(huán)狀(圖4A)，質(zhì)膜破損(圖4B)，核表面形成針狀突起(圖4D)，線粒體腫脹、形態(tài)大小不一(圖4C)。保存至96 h，60.7%精子出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷(圖6)，部分精子表現(xiàn)為核電子密度減低并崩解碎裂(圖5A、5B)，核畸形(圖5D)，線粒體缺失、排列混亂或位置異常(圖5B、5C)。部分精子出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)特征，如：核表面形成針狀突起(圖4D)，核周出現(xiàn)囊性空泡和凋亡小體(圖4D、5D)。

A.0 h，形態(tài)正常精子；B～C.0 h，形態(tài)正常精子

A.48 h精子形態(tài)，箭頭指向核膜膨脹折疊；B.48 h精子形態(tài)，箭頭指向質(zhì)膜破損；C.48 h精子形態(tài)，箭頭指向線粒體腫脹；D.48 h精子形態(tài)，箭頭指向核表面針狀突起，囊性空泡和凋亡小體

A.96 h精子形態(tài)，箭頭指向核崩解碎裂；B.96 h精子形態(tài)，箭頭指向核崩解碎裂，線粒體缺失，排列混亂；C.96 h精子形態(tài)，箭頭指向線粒體缺失，排列混亂；D.96 h精子形態(tài)，箭頭指向核畸形，囊性空泡和凋亡小體

*P<0.05與0 h對(duì)比

3 討 論

精液保存是加速奶山羊良種擴(kuò)繁的關(guān)鍵技術(shù)，4 ℃液態(tài)保存精液可避免凍融過程對(duì)精子造成的損傷，同時(shí)抑制精子代謝速率，可有效提高精子存活率和體外受精能力。目前，國(guó)內(nèi)采用人工授精技術(shù)的山羊養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)用的精液主要以液態(tài)保存為主[11]。本試驗(yàn)采用4 ℃液態(tài)保存關(guān)中奶山羊精子，發(fā)現(xiàn)其活率呈時(shí)間依賴性逐漸下降，保存至第6天時(shí)活率已小于50%，表明4 ℃液態(tài)保存下奶山羊精子活率下降快，保存時(shí)間較短。

精子結(jié)構(gòu)完整性是評(píng)估精液質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[12]。本研究通過電子顯微鏡觀察4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子超微結(jié)構(gòu)變化，奶山羊正常精子結(jié)構(gòu)與之前報(bào)道的綿羊、山羊精子形態(tài)結(jié)構(gòu)一致[13-14]。4 ℃液態(tài)保存條件下，大量精子出現(xiàn)質(zhì)膜不完整、頂體破損，尤其是頭部質(zhì)膜明顯損傷。質(zhì)膜和頂體是精子結(jié)構(gòu)的重要組成部分，對(duì)精子受精過程至關(guān)重要。研究表明，精子獲能和頂體反應(yīng)過程中質(zhì)膜損傷會(huì)造成精子活率和受精能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致奶山羊受胎率降低[15]。頂體完整性是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的另一個(gè)重要指標(biāo)，是成功受精的先決條件[11]。精子頂體破損導(dǎo)致頂體內(nèi)容物喪失，進(jìn)而影響精子獲能、頂體反應(yīng)和受精能力[16]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)精子線粒體結(jié)構(gòu)損傷明顯。線粒體作為精子能量代謝的調(diào)控中心，是精子運(yùn)動(dòng)的能量來源。線粒體結(jié)構(gòu)損傷不僅影響精子尾部運(yùn)動(dòng)和受精過程的能量供給，而且會(huì)降低精子活率[17]，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，影響液態(tài)保存效果。值得注意的是，部分精子出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)特征。凋亡是細(xì)胞自主的程序化死亡過程，是生殖細(xì)胞死亡的主要方式之一[18]。大量研究表明，人[19]、兔[20]和綿羊[21]等精子在保存過程中會(huì)發(fā)生凋亡，凋亡是影響精液保存質(zhì)量的一項(xiàng)關(guān)鍵生理機(jī)制。由此可見，4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子發(fā)生凋亡，其可能是影響液態(tài)保存效果的關(guān)鍵因素之一。綜上所述，4 ℃液態(tài)保存中奶山羊精子活率顯著下降，同時(shí)伴隨著明顯的結(jié)構(gòu)損傷，部分精子出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，以上形態(tài)學(xué)研究結(jié)果為后續(xù)深入研究奶山羊精子液態(tài)保存奠定形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

4 ℃液態(tài)保存過程中，大量精子出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，部分精子具有典型的凋亡形態(tài)特征，同時(shí)精子活率逐漸降低，提示液態(tài)保存中奶山羊精子結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致活率下降。